衛(wèi)旭東 黨 源 溫福利 薛來恩 張?jiān)娞m 鄭和平

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院?？偨虒W(xué)醫(yī)院(解放軍福州總醫(yī)院)骨科研究所，福州 350025) (2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，福州 350025)

關(guān)節(jié)軟骨退變或損傷是臨床上常見的問題，由于其是無神經(jīng)、血管的終末分化組織，自身修復(fù)十分困難。臨床上使用的自體、異體移植或者生物材料均不能從根本上解決軟骨缺損的修復(fù)問題。新興的組織工程軟骨是目前最具潛力的修復(fù)方法，種子細(xì)胞、支架材料和誘導(dǎo)因子是修復(fù)再生的三大主導(dǎo)因素[1]。這其中最重要、最基本的就是選擇一種種子細(xì)胞，具有向軟骨分化的優(yōu)勢(shì)。近年來也發(fā)現(xiàn)了多種間充質(zhì)干細(xì)胞具有向軟骨分化的潛能，其中滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Synovial mesenchymal stem cells, SMSCs) 取材方便易分離，和關(guān)節(jié)軟骨屬于近親同源組織，向軟骨分化潛能最大[2]，在體外培養(yǎng)較其他間充質(zhì)干細(xì)胞能產(chǎn)生更多的軟骨基質(zhì)，并在多次傳代后依舊保持高度成軟骨特性[3-4]。其優(yōu)良的生物學(xué)特性，成為再生軟骨領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)中，使用腺病毒介導(dǎo)BMP-4基因感染兔SMSCs，并嵌入EGFP基因作為報(bào)告基因，對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，摸索合適的轉(zhuǎn)染條件。觀察以腺病毒為載體攜帶的外源性BMP-4基因轉(zhuǎn)入SMSCs所發(fā)生的生物學(xué)特性及向軟骨細(xì)胞定向分化能力的變化，為SMSCs在以基因工程為基礎(chǔ)的組織工程修復(fù)軟骨方面的研究、應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1月齡雄性新西蘭兔8只，普通級(jí)，體質(zhì)量(1 000±200)g。由福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場(chǎng) [SCXK(閩)2014-0001]提供，合格證編號(hào)為35002000000082。飼養(yǎng)于解放軍福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科普通環(huán)境[SYXK(軍)2013-0004]。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)倫理要求，并按照3R原則給予人道的關(guān)懷[7]。

1.2 方法

1.2.1SMSCs的獲取與培養(yǎng):用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質(zhì)量)將新西蘭兔麻醉成功后，膝關(guān)節(jié)脫毛、溫水洗凈，仰臥位固定。膝關(guān)節(jié)髕骨旁切口，仔細(xì)分離至滑膜組織，將關(guān)節(jié)囊外包裹的滑膜組織和膝關(guān)節(jié)韌帶一并取出，置于含10 000U/mL青霉素, 10 000 μg/mL鏈霉素的PBS中，移入超凈臺(tái)，紫外燈照射15 min，PBS沖洗后，將組織剪成1 mm3大小，放入5倍體積的4%Ⅰ型膠原酶，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中消化3 h。用200目濾網(wǎng)過濾、收集、清洗細(xì)胞后以1200 r/min離心5 min，用含15%FBS的H-DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，按2×105個(gè)/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，48 h后換液，建立原代培養(yǎng)的細(xì)胞，每2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到85%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2傳代。每天以顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況，傳至第2代供實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定:每天通過顯微鏡觀察P1、P2代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及集落形態(tài)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMSCs表面抗原:將P2代細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶消化。取1×105細(xì)胞，加入熒光抗體CD44-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC和各抗體相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，室溫避光靜置20 min。離心去除上清液，流式儀檢測(cè)計(jì)數(shù)各項(xiàng)陽性、陰性細(xì)胞百分比。

1.2.4重組BMP-4的腺病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建:重組BMP-4的腺病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建、擴(kuò)增和滴度測(cè)定，由上海吉瑪公司完成。

1.2.5Ad-BMP-4感染SMSCs及其效率分析:取P2代生長(zhǎng)旺盛的兔SMSCs消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以4×105個(gè)/mL接種至6孔板中。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h，使用病毒滴度為5×109TU/mL的ADV4-BMP-4的病毒液感染細(xì)胞，分組為空白對(duì)照組、50、100、200、300、400、500MOI感染組，均以2%FBS濃度的DMEM維持24 h后首次換液，之后每2天換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后使用倒置熒光顯微鏡觀察各組熒光強(qiáng)度，并重懸細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組綠色熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6感染后SMSCs生長(zhǎng)曲線:將感染不同MOI值的SMSCs按2000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組MOI設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，放入37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在第0、1、3、5、7天加入CCK-8試劑后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線。綜合對(duì)照明場(chǎng)下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)評(píng)估最佳MOI。

1.2.7感染后的SMSCs向軟骨細(xì)胞分化:選取最佳MOI(MOI=300)值后，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置以下3組，分別為實(shí)驗(yàn)組：經(jīng)最佳MOI值A(chǔ)d-BMP-4感染的SMSCs，記為Ad-BMP-4(+)；空載體組：經(jīng)ADV-NC感染，記為Ad-BMP-4(-)；空白對(duì)照組：未經(jīng)病毒感染的SMSCs。

1.2.8感染SMSCs后相關(guān)蛋白表達(dá):將3個(gè)實(shí)驗(yàn)組以培養(yǎng)的第1、3、5、7天為四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解液，用ELISA檢測(cè)SMSCs成軟骨細(xì)胞過程中相關(guān)蛋白表達(dá)的改變(如BMP-4、SOX9、COLⅡ、AGC的表達(dá))。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 SMSCs鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)：原代細(xì)胞融合至90%大約需要7 d時(shí)間，呈滴蠟狀(圖1 A)。傳代后P2代生長(zhǎng)迅速，3 d融合至90%，具有典型的成纖維樣形態(tài)，緊密排列呈梭形，細(xì)胞密度增高，融合時(shí)呈現(xiàn)漩渦狀傾向(圖1B)。

2.1.2流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)SMSCs表面標(biāo)記：取第2代SMSCs經(jīng)4種流式抗體結(jié)合后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示SMSCs高表達(dá)CD44(98.5%)、CD90(96.86%)。而造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記物CD34(3.75%)、CD45(2.63%)表達(dá)程度非常低(表1)。

表1 SMSCs細(xì)胞表面各種標(biāo)記所占百分比Table 1 SMSCs various cell surfacemarkers as a percentage

圖1 SMSCs細(xì)胞(×100)注：A：P1代SMSCs細(xì)胞;B：P2代SMSCs細(xì)胞Fig.1 SMSCs cells (×100)Note: A: P1 generation SMSCs cells,B:P2 generation SMSCs cells

圖2 不同MOI值轉(zhuǎn)染P2代SMSCs 48 h在熒光顯微鏡下的表現(xiàn)(100×)注：A. 50MOI；B. 100MOI；C. 200MOI；D. 300MOI；E. 400MOI；F. 500MOIFig.2 The second generation of SMSCs transfected with different MOI values48 h under fluorescence microscope (×100)Note:A. MOI=50；B. MOI=100；C. MOI=200；D. MOI=300；E. MOI=400；F. MOI=500

圖3 空白組和Ad-BMP-4感染P2代SMSCs注：A.空白組(0MOI)；B. MOI=50；C. 100 MOI；D. 200MOI；E. 300MOI；F. 400MOI；G. 500MOIFig.3 Blank group and Ad-BMP-4 infected P2 generation SMSCsNote:A.Blank group；B. MOI=50；C. MOI=100；D. MOI=200；E. MOI=300；F. MOI=400；G. MOI=500

2.2 Ad-BMP-4轉(zhuǎn)染SMSCs效率

Ad-BMP-4按MOI分別為50、100、200、300、400、500轉(zhuǎn)染P2代SMSCs后48 h，在熒光顯微鏡下即可觀察到不同強(qiáng)度的綠色熒光(圖2)。隨著MOI值增大，表達(dá)綠色熒光細(xì)胞的百分比增多，熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光標(biāo)記百分率分別為54.3%、72.2%、77.8%、85%、86.6%、89.3%(圖3，表2)。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADV4-BMP-4轉(zhuǎn)染SMSCs的效率Table 2 Flow cytometry was used to detect the efficiencyof ADV4-BMP-4 transfected SMSCs

2.3 感染后SMSCs生長(zhǎng)曲線

不同MOI值感染SMSCs后，分別在第0、1、3、5、7天加入CCK-8試劑后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖4)。結(jié)合感染效率，當(dāng)MOI達(dá)到300時(shí)，繼續(xù)增大MOI一方面增加標(biāo)記及表達(dá)率效價(jià)比不高，另一方面隨著MOI增大不可避免地使細(xì)胞毒性增加，并對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖4 使用不同MOI值的ADV-BMP-4感染P2代SMSCsFig.4 Generation 2 SMSCs were transfected withADV-BMP-4 at various MOI values

2.4 ELISA法檢測(cè)感染后SMSCs相關(guān)成軟骨蛋白表達(dá)

圖5 SMSCs相關(guān)成軟骨蛋白表達(dá)情況注：A. BMP4表達(dá)水平； B. COLⅡ 表達(dá)水平； C. AGC表達(dá)水平； D. SOX9表達(dá)水平Fig.5 SMSCs-related cartilage protein expressionNote:A. BMP4 expression level；B. COLⅡexpression level；C.AGC expression level；D. SOX9 expression level

Ad-BMP-4(+)、Ad-BMP-4(-)以MOI=300值感染P2代SMSCs，第1、3、5、7天時(shí)收集細(xì)胞裂解液，ELISA檢測(cè)BMP-4、SOX9、COLⅡ的表達(dá)情況。Ad-BMP-4(+)組與空白對(duì)照組、Ad-BMP-4(-)組相比，BMP-4、SOX9、COLⅡ和AGC在蛋白水平的表達(dá)均有增高(P<0.05)(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了經(jīng)ADV-BMP-4感染后的SMSCs能高效表達(dá)BMP-4蛋白，并表達(dá)軟骨細(xì)胞特有的Ⅱ型膠原、Aggrecan和SOX9蛋白，說明BMP-4能夠促進(jìn)SMSCs分泌成軟骨相關(guān)特異性因子，誘導(dǎo)SMSCs向軟骨分化。

3 討論

隨著不科學(xué)的運(yùn)動(dòng)鍛煉和人口老齡化加劇等因素使骨關(guān)節(jié)發(fā)病率增高，關(guān)節(jié)軟骨損傷現(xiàn)象在臨床上日益多見。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSC)和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSC)是目前組織工程研究中用于修復(fù)軟骨的種子細(xì)胞。SMSCs是一類存在于關(guān)節(jié)滑膜組織中的多能干細(xì)胞。SMSC首次是由De Bari等[8]從人滑膜組織中成功分離，具有多向分化潛能。研究了幾種間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外軟骨形成潛能時(shí)，發(fā)現(xiàn)滑膜來源的SMSC在細(xì)胞倍增速率、集落形成和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)優(yōu)于其他的MSC，修復(fù)軟骨損傷更具優(yōu)勢(shì)[9-11]。滑膜中MSC占比很高，持續(xù)擴(kuò)增10代以上依舊維持相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征，在同一條件下以SMSCs的成軟骨能力最強(qiáng)[12]，Yoshimura和Koga在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)都得到了同樣的結(jié)果[10,13]，并且間充質(zhì)干細(xì)胞沒有致瘤性[14]。其在軟骨損傷修復(fù)中具有重要價(jià)值。

生長(zhǎng)因子在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化方面舉足輕重。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)，是一類廣泛存在，在組織器官發(fā)育與胚胎骨骼形成密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的蛋白質(zhì)分子，是誘導(dǎo)游走間質(zhì)干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的必要信號(hào)分子[15]。BMP-4在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化進(jìn)程中成效顯著，通過促進(jìn)軟骨特異性Ⅱ型膠原、蛋白多糖的合成增加新生軟骨的各項(xiàng)生化特性[16-17]。近年來基因重組的BMP-2和BMP-7的安全性和有效性得到了充分的證實(shí)，2002年7月FDA已批準(zhǔn)重組BMP-2用于臨床。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)BMP-4基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMSCs，使用ELISA試劑盒檢測(cè)感染后第1、3、5、7天細(xì)胞裂解液發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的BMP-4蛋白表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)、不斷上升態(tài)勢(shì)，與空白組和對(duì)照組差異明顯。此過程中實(shí)驗(yàn)組的成軟骨相關(guān)基因SOX9、COLⅡ和AGC均高表達(dá)，與空白組存在明顯差異。天然透明軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中主要為膠原和蛋白多糖，膠原中Ⅱ型膠原占據(jù)大部分，與眾多的蛋白纖維和多糖交織呈網(wǎng)狀，維持軟骨微環(huán)境，是軟骨細(xì)胞的特征性標(biāo)志，AGC(aggrecan)蛋白對(duì)軟骨組織彈性及生物力學(xué)抗壓性能方面起重要作用，它們的出現(xiàn)是間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的一個(gè)關(guān)鍵性標(biāo)志[18]。我們?cè)贑OLⅡ蛋白表達(dá)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，不僅實(shí)驗(yàn)組呈高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的COLⅡ表達(dá)水平自始至終比空白組高，也呈上升趨勢(shì)；AGC蛋白檢測(cè)顯示空載組在第7天表達(dá)量明顯高于空白組。具體原因及機(jī)制值得我們后續(xù)深入研究。

慢病毒和腺病毒是目前相關(guān)感染實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的基因載體。慢病毒能夠感染多種難以感染的細(xì)胞，并可以將外源基因插入基因組內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定感染，能長(zhǎng)期表達(dá)，但存在發(fā)生基因重組的隱患。腺病毒不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限感染效率高，基因不會(huì)插入基因組中，安全性高、免疫排斥反應(yīng)低，因而不產(chǎn)生突變或致癌，并且基因表達(dá)只能維持一定時(shí)期，而后表達(dá)逐漸降低直至消失，屬于瞬時(shí)表達(dá)[19]。關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨損傷使用干細(xì)胞修復(fù)是一個(gè)階段性的過程，要求在修復(fù)期表達(dá)足夠的生長(zhǎng)因子激發(fā)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化即可，而生長(zhǎng)因子的外源性使用存在難以控制濃度，稀釋降低效價(jià)，而長(zhǎng)期高表達(dá)的軟骨誘導(dǎo)因子不可避免的造成其在受區(qū)維持高濃度，通過組織液向臨近組織彌散，從而造成不必要的異位骨化及不良反應(yīng)的發(fā)生[20-21]。因而在軟骨修復(fù)研究中使用腺病毒作為基因載體是較為理想的選擇。根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)隨著MOI值得不斷增大，細(xì)胞感染效率得到了提升，為了保證高感染效率的同時(shí)能夠保證細(xì)胞增殖活性，我們對(duì)不同MOI值做了增值曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI大于300后細(xì)胞增殖率明顯降低，感染效率提升效價(jià)比低，明場(chǎng)下觀察細(xì)胞，死亡數(shù)量明顯增多，活力明顯下降。本實(shí)驗(yàn)中選取MOI=300作為感染量是合適的，并且感染了外源性BMP-4啟動(dòng)并促進(jìn)了SMSCs的軟骨分化，實(shí)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞作為組織細(xì)胞修復(fù)基石的同時(shí)，自身攜帶目的基因?qū)崿F(xiàn)基因治療，為組織工程軟骨修復(fù)提供了更加優(yōu)秀的“種子細(xì)胞—生長(zhǎng)因子”整合構(gòu)建方法，避免了外源性生長(zhǎng)因子的多次反復(fù)注射，也符合當(dāng)前骨科治療的“微創(chuàng)”原則。