任德偉，鐘錦 ，楊敬

（重慶市中醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶40000）

腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎病的共同途徑，是由多種細胞因子介導、多信號通路參與的病理過程，以細胞外基質成分過度沉積和腎間質成纖維細胞增生導致的腎臟結構破壞、功能喪失為特征[1]。微小RNA（microRNA, miRNA）是一類短鏈小分子非編碼RNA，廣泛參與腎臟的生理和病理過程[2]。miR-200c是miR-200家族重要成員之一，其位于染色體12p13.31上，較多的研究發(fā)現(xiàn)，器官纖維化時miR-200c表達明顯下調，如miR-200c在肺[3]、腹膜[4]、皮膚[5]等器官纖維化時表達均明顯降低，但至今有關miR-200c與腎臟纖維化關系的研究甚少，并且作用機制尚不清楚。TGF-β/Smad信號通路與臟器纖維化的關系密切，TGF-β1和Smad3是TGF-β/Smad信號通路最重要的調控因子，在臟器纖維化中起促進作用[6,7]。研究證實miR-200c可以調控TGF-β1/Smad3信號通路參與機體生理和病理過程[8]。單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstmction,UUO）可以導致實驗動物模型出現(xiàn)腎纖維化，是目前研究腎纖維化最常用的方法[9]。本研究通過建立UUO腎間質纖維化小鼠模型，觀察miR-200c在UUO小鼠腎組織中的表達變化及其對UUO小鼠腎間質纖維化和TGF-β1/Smad3通路的影響。

材料與方法

1 實驗動物

健康雄性SPF級C57BL/6J小鼠45只，體重21～26g，購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。于室溫安靜環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，晝夜交替，自由飲食飲水，適應環(huán)境1w。本研究中所有動物的實驗操作均符合動物倫理學標準。

2 藥物與試劑

Scr和BUN 測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Allin-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit購自廣州復能基因有限公司；agomir-200c、miR-200c和U6引物購自上海生工生物工程公司；Masson 染色試劑盒購自福州邁新生物公司；一抗TGF-β1、Smad3、α-SMA抗體、GAPDH抗體和HRP標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

3 UUO模型制備、分組及取材

所有C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字表法分為假UUO組、UUO組、UUO+agomiR-200c組，每組15只。UUO組和UUO+agomiR-200c組參考文獻[10,11]通過結扎左側輸尿管建立的腎纖維化模型：5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，切開腹腔暴露左腎，游離左輸尿管，于腎門處結扎輸尿管，于輸尿管的遠離腎門處二次結扎，在兩處結扎中間離斷輸尿管后縫合腹腔。假UUO組僅游離左側輸尿管，但不進行結扎和離斷輸尿管的操作；手術操作均嚴格按無菌原則進行。UUO+agomiR-200c組于手術后第1、7、14d給予30mg/kg的agomir-200c尾靜脈注射，UUO 組以等量生理鹽水尾靜脈注射。在建立模型后21d麻醉處死所有小鼠，心臟取血，用于測定SCr和BUN。取小鼠梗阻側腎臟組織，留取一半腎組織，4%甲醛溶液固定，用于病理染色；剩余組織置于液氮中速凍后置于-80℃低溫冰箱保存，用于qRT-PCR和Western blotting的檢測。

4 血測定血肌酐和血尿素氮檢測

麻醉處死小鼠后心臟取血，離心取上層血清，全自動生化分析儀檢測血測定血肌酐（Scr）、和血尿素氮（BUN）的水平。

5 qRT-PCR檢測腎組織miR-200c的表達

取凍存的小鼠腎組織勻漿后，RNA的抽取按照TRIzol試劑說明書進行，并使用紫外分光光度計測定總RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA質量。取總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書操作逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，參照qPCR試劑盒說明書配置PCR體系后，應用實時定量PCR儀進行qPCR,PCR循環(huán)條件：95℃，10min；45個循環(huán)（95℃，10s，60℃，20s，72℃，10s）。以 U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算miR-200c相對表達量。

6 腎組織病理性檢查

腎組織經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后切5μm厚石蠟片，經(jīng)過脫蠟、浸泡等常規(guī)處理后HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織的病理學改變。腎小管間質損傷病理評分采用半定量標準進行評分[12], 進行半定量分析，評分標準如下：0分，腎小球無病變；1分，腎小球病變面積＜25%；2分，腎小球病變面積25%～50%；3分，腎小球病變面積51%～75%；4分，腎小球病變面積＞75%。參考文獻[13]依據(jù)Masson染色結果每例切片隨機選取10個腎小管間質不重復視野，計算膠原容積分數(shù)（CVF），藍色膠原沉積為Masson陽性染色，CVF=膠原面積/腎間質總面積，腎間質總面積為除去腎小管管腔面積后的腎間質面積。

7 Western blotting檢測腎組織TGF-β1、Smad3及α-SMA水平

取凍存的小鼠腎組織用RIPA裂解，離心取裂解上清液，二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白濃度定量。蛋白上樣，SDS-Page電泳，電轉移至PVDF膜。室溫脫脂奶粉封閉1h后加入一抗（TGF-β1、Smad3、α-SMA抗體及GAPDH抗體）, 4℃孵育過夜，TBST洗3次后再加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次后，ECL顯像曝光后凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Quality one進行條帶光密度值測定，應用GADPH作為內(nèi)參，以目的條帶光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值表示蛋白相對水平。

8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以（ˉx±s）表示，比較采用單因素方差分析及t檢驗，P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 單側輸尿管梗阻降低腎組織中miR-200c表達水平

為了觀察單側輸尿管梗阻性小鼠腎組織中miR-200c的表達變化，應用qRT-PCR檢測腎組織miR-200c表達水平。結果顯示，與假UUO組比較，UUO組小鼠腎組織miR-200c的表達水平較假UUO組明顯降低；UUO+agomiR-200c組小鼠腎組織miR-200c的表達明顯高于UUO組（圖1）。由此表明，agomiR-200c能夠糾正UUO小鼠腎組織中miR-200c表達的降低。

2 過表達miR-200c減輕單側輸尿管梗阻性腎功能損傷

為了觀察過表達miR-200c對單側輸尿管梗阻性腎功能損傷的影響，應用全自動生化分析儀檢測血清Scr和BUN，結果顯示，與假UUO組比較，UUO組小鼠血清Scr和BUN水平較假UUO組明顯升高，UUO+agomiR-200c組小鼠血清Scr和BUN水平明顯低于UUO組（表1）。由此表明，過表達miR-200c能減輕單側輸尿管梗阻性腎功能損傷。

圖1 單側輸尿管梗阻對腎組織中miR-200c表達的影響。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；與假UUO組比較：#P＜0.01；與UUO組比較：*P＜0.01Fig.1 The effect of unilateral ureteral obstruction on the expression level of miR-200 in renal tissue. A, Sham UUO group; B, UUO group;C, UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

表1 過表達miR-200c對單側輸尿管梗阻性腎功能損傷的影響Tab. 1 The effect of miR-200c upregulation on the renal functions of mice with unilateral ureteral obstruction

3 過表達miR-200c降低單側輸尿管梗阻小鼠腎小管間質損傷病理評分及腎膠原容積分數(shù)

肉眼觀，假UUO組小鼠腎臟形態(tài)色澤正常，左腎（梗阻側腎）與右腎無明顯差別。UUO組和UUO+agomiR-200c組小鼠左腎（梗阻側腎）表面血管增粗，包膜緊張，左腎明顯大于右腎，并且左腎較右腎顏色變淺；UUO+agomiR-200c組小鼠腎臟形態(tài)學改變較UUO組明顯減輕。

HE染色顯示，假UUO組小鼠腎小球、腎小管及腎間質正常，未見明顯損傷表現(xiàn)；UUO組小鼠腎臟可見腎小管管腔擴張明顯，腎間質增寬，大量炎性細胞浸潤；UUO+agomiR-200c組小鼠腎臟病理性改變較UUO組明顯減輕（圖2）。計算腎小管間質損傷病理評分結果顯示：與假UUO組比較，UUO組小鼠腎小管間質損傷病理評分較假UUO組明顯增加；UUO+agomiR-200c組小鼠腎小管間質損傷病理評分明顯低于UUO組（圖3）。由此表明，過表達miR-200c能降低單側輸尿管梗阻性小鼠腎小管間質損傷病理評分。

圖2 過表達miR-200c對小鼠單側輸尿管梗阻性腎病理變化影響的HE染色檢測。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；比例尺，50μmFig. 2 HE staining to observe the effect of miR-200c upregulation on the pathological changes of renal tissues in mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; scale bar, 50μm

圖3 腎小管間質損傷病理評分。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；與假UUO組比較：#P＜0.01；與UUO組比較：*P＜0.01Fig. 3 Pathological score of renal tubulointerstitial injury. A, Sham UUO group; B, UUO group; C，UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

Masson染色檢測顯示，假UUO組小鼠腎組織Masson陽性染色正常，主要分布于腎小管基膜、系膜區(qū)和腎小管毛細血管周圍；UUO組小鼠腎間質中膠原纖維（藍染）明顯增多；UUO+agomiR-200c組小鼠腎間質中膠原纖維（藍染）較UUO組明顯減少（圖4）。計算腎膠原容積分數(shù)（CVF）結果顯示：與假UUO組比較，UUO組小鼠CVF較假UUO組明顯增加；UUO+agomiR-200c組小鼠CVF明顯低于UUO組（圖5）。由此表明，過表達miR-200c能降低單側輸尿管梗阻性小鼠腎膠原容積分數(shù)。

圖5 Masson染色膠原容積分數(shù)。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；與假UUO組比較：#P＜0.01；與UUO組比較：*P＜0.01Fig. 5 Collagen volume fraction in Masson staining. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

圖4 過表達miR-200c對小鼠單側輸尿管梗阻性腎病理變化影響的Masson染色檢測。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；比例尺，50μmFig. 4 Effect of miR-200c upregulation on the pathological changes of renal tissues examined by Masson staining in mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; scale bar, 50μm

4 過表達miR-200c降低單側輸尿管梗阻小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA的上調

Western blot檢測顯示，與假UUO組比較，UUO組小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平較假UUO組明顯升高，UUO+agomiR-200c組小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平明顯低于UUO組（圖6）。由此可見，過表達miR-200c能降低單側輸尿管梗阻性小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平的表達。

圖6 過表達miR-200c對單側輸尿管梗阻小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平的影響。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組Fig. 6 The effects of miR-200c upregulation on the levels of α-SMA,TGF-β1 and Smad3 in the renal tissues of mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group

討 論

腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎病的共同病理特征，表現(xiàn)為腎臟固有細胞缺失，腎單位結構破壞，成纖維細胞和肌成纖維細胞增生，生成大量細胞外基質堆積，導致腎臟功能喪失。腎間質纖維化是多種細胞因子和信號通路參與[14]，具體機制尚未完全清楚。本研究中我們建立UUO小鼠模型發(fā)現(xiàn)，小鼠梗阻側腎臟較右腎明顯增大，腎臟表面血管增粗，包膜緊張，顏色變淺，腎小管間質損傷病理評分下降，腎膠原容積分數(shù)（cVF）增加，腎組織中α-SMA蛋白表達水平增高，以上均提示UUO造模成功。

miRNAs是一類長約18～23nt的小分子非編碼RNA，其可以通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)特異性結合，在轉錄后水平對靶基因的表達進行調控，起著促進或者抑制腎臟纖維化的作用[15]。Sun等[16]學者發(fā)現(xiàn)miR-181c可以通過抑制EMT減輕環(huán)孢霉素A誘導的腎臟損傷和纖維化。Bijkerk等[17]報道沉默miR-132的表達能夠通過抑制肌成纖維細胞的增殖減輕腎纖維化。Fang等[18]發(fā)現(xiàn)miR-382在UUO小鼠模型中表達減低，上調miR-382的表達可以通過抑制HSPD1的表達減輕腎臟纖維化進程。本研究中我們發(fā)現(xiàn)UUO組小鼠腎組織中miR-200c的表達明顯降低，提示miR-200c可能與腎纖維化密切相關。

TGF-β1/Smad3信號通路是腎纖維化重要的調控通路。TGF-β1是一種促纖維化始動因子，通過TGF-β1/Smads信號通路參與機體器官纖維化的調控。TGF-β1能誘導成纖維細胞表達α-SMA而形成肌成纖維細胞，加速纖維化組織收縮，進而加重腎組織缺血缺氧，導致腎纖維化，研究已證實嚙齒類動物中過表達TGF-β1可誘導腎纖維化反應[19]。腎纖維化動物模型中也已證實TGF-β1明顯上調[20],使用TGF-β1中和抗體或使其受體的基因缺失能夠明顯減緩腎纖維化[21]。Smads是TGF-β家族信號的轉導分子，其中Smad3是Smads家族重要成員之一，屬于受體活化型Smad蛋白，是TGF-β1信號下游的第一個信號分子，被認為在TGF-β1信號通路上起著必不可少的核心作用[22]。TGF-β1與細胞受體結合后活化Smad3，通過核膜進入核內(nèi)，通過直接與DNA結合實現(xiàn)促纖維化的作用[23]。miR-200c可以調控TGF-β1/Smad3信號通路，并且TGF-β1可以反過來調控miR-200c，TGF-β1可以通過誘導Smad3與位于miR-200c啟動子序列上的Smad結合位點結合，從而抑制miR-200c表達[8]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)UUO組小鼠腎組織中TGF-β1和Smad3的表達明顯增高，而給予agomiR-200c干預的UUO小鼠腎組織中miR-200c表達明顯升高，TGF-β1和Smad3的表達明顯下降，并且血清Scr、BUN水平明顯降低，腎小管間質損傷評分明顯下降，腎膠原容積分數(shù)減少，腎組織中α-SMA蛋白表達也明顯降低，提示miR-200c可以通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路活性，減輕UUO小鼠腎纖維化，從而改善腎功能。

綜上所述，本研究證實miR-200c在腎纖維化小鼠腎組織中表達明顯減低，上調miR-200c能夠通過抑制TGF-β1/Smad3通路減輕UU0小鼠腎間質纖維化進程，可能成為腎纖維化治療的潛在靶點。