徐菁苒 ，毛 健 *， 劉雙平 ，周志磊

(1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

蘋果酒是用蘋果汁發(fā)酵制得的一種營養(yǎng)豐富、低酒精度的發(fā)酵制品，是僅次于葡萄酒的第二大果酒。蘋果酒富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)以及鈣、鐵、磷、鉀等成分，不僅口感醇厚，酒香協(xié)調(diào)，且具有一定保健功效[1]。褐變是蘋果酒生產(chǎn)與貯存過程中的一個重要問題，既影響酒體色澤、酒質(zhì)和風(fēng)味，又會造成一些營養(yǎng)物質(zhì)的損失[2-3]。褐變的實質(zhì)是蘋果及蘋果酒中的多酚物質(zhì)發(fā)生氧化，在生產(chǎn)過程中，既存在酶促褐變又有非酶促褐變[4-5]。目前，抑制果酒褐變主要有物理、化學(xué)2種方法，其中在釀造及貯存過程中普遍應(yīng)用的一種化學(xué)添加劑就是SO2，SO2雖具有很好的抗氧化性，但大量研究結(jié)果表明，它對人體健康會產(chǎn)生很大的危害[6-7]。隨著社會發(fā)展，健康觀念已越來越深入人心，人們對化學(xué)合成抑制劑的安全疑慮日益增加[8]，為此，找到替代SO2的天然抗氧化物質(zhì)，并利用生物方法達(dá)到抑制褐變的效果，已經(jīng)成為果酒行業(yè)的研究熱點。

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的三肽化合物，具有抗氧化、清除自由基、解毒等生理功能[9-10]。目前，利用微生物的物質(zhì)代謝進(jìn)行GSH生物合成已得到廣泛的應(yīng)用，發(fā)酵法生產(chǎn)GSH所用的菌種以釀酒酵母最為常見，主要通過γ-谷氨酰循環(huán)進(jìn)行代謝[11]。因此，具有高GSH合成能力的菌株是提高GSH合成效率的關(guān)鍵。研究表明，GSH具有抑制果酒褐變的功效，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性[12]。而作為酵母菌的代謝產(chǎn)物，在不引入外源物質(zhì)的前提下，通過篩選一株高產(chǎn)GSH的果酒酵母，利用微生物代謝抑制蘋果酒在發(fā)酵過程中的多酚褐變，從而減少SO2等抗氧化劑的使用。

本文中探究了GSH對多酚褐變的抑制效應(yīng)，并以14株果酒酵母作為實驗材料，篩選出一株高產(chǎn)GSH的酵母菌株Y-18，該菌株能在降低果酒褐變值的同時保持較好的發(fā)酵特性。此研究利用生物方法減少褐變對果酒品質(zhì)的影響，為高品質(zhì)果酒的開發(fā)提供參考，在提高果酒安全性的前提下降低成本，具有廣闊的研究前景。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料 新鮮富士蘋果，購自市場，4℃保藏，使用前在25℃室溫放置2 h。

1.1.2 酵母菌株 01號（31814菌株）、02號（31906菌株）、03號（31693菌株），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；04#號 （2.2076菌株）、05#號（2.3848 菌株）、06# 號（2.2084 菌株）、07# 號（2.3851菌株），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；Y1401、Y1402、Y1403、Y-18、Y-RW、Y-SY、Y 菌株，實驗室保藏菌株，14株酵母菌均為釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、無水乙醇、檸檬酸、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸鈉、磷酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉購自國藥集團(tuán)；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、L-半胱氨酸、谷胱甘肽，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，沃特世（Waters）科技有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；榨汁機(jī)，蘇泊爾股份有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床，上海合恒儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；7230G可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；HG101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)，德國eppendorf公司產(chǎn)品；FA2004N電子分析天平，梅特勒-托利多愛儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；HH-S2系列恒溫水浴鍋，上海百典儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KQ-700E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YPD固體培養(yǎng)基 酵母粉10 g/L，魚粉蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L；pH自然，0.1 MPa滅菌15 min。

1.2.2 YPD液體培養(yǎng)基 酵母粉10 g/L，魚粉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；pH自然，0.1MPa滅菌15min。

1.2.3 搖瓶培養(yǎng)基 葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸銨6 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.1 g/L；0.1 MPa滅菌15 min。

1.2.4 蘋果汁活化培養(yǎng)基 調(diào)節(jié)蘋果汁糖度為20°Brix，用檸檬酸調(diào)整培養(yǎng)基pH 3.5，酵母菌接種體積分?jǐn)?shù)為5%，在25℃下發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.5 蘋果汁發(fā)酵培養(yǎng)基 調(diào)節(jié)鮮榨蘋果汁糖度為20°Brix，調(diào)整培養(yǎng)基pH 3.5，酵母菌按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入蘋果汁，在25℃下發(fā)酵。

1.3 實驗方法

1.3.1 GSH對鮮榨蘋果汁褐變的抑制效果 新鮮蘋果，經(jīng)自來水清洗、去核、切塊、榨汁、離心、過濾后，分別加入抗氧化劑GSH、抗壞血酸（VC）、L-半胱氨酸（L-cys）、二氧化硫（SO2），濃度分別為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L。以空白為對照，立即測定試樣品在420 nm下的光密度值（OD值）；其余樣品倒在培養(yǎng)皿，敞口放置在室溫下以便充分氧化褐變，24 h后測定各試樣OD420值。褐變值的變化率表示不同抗氧化劑對鮮榨蘋果汁褐變的抑制效果，每個試樣3次重復(fù)，取平均值。

式中，A0為 0 h OD420值；A1為 24 h 后 OD420值；A2為△OD420值；I為△OD420變化率。

1.3.2 果酒酵母發(fā)酵力測定 挑取酵母菌斜面種子一環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖瓶振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液。將種子液按10%接種體積分?jǐn)?shù)接種到Y(jié)PD液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃靜態(tài)發(fā)酵，每隔24 h稱一次質(zhì)量，計算各株酵母菌發(fā)酵時產(chǎn)生CO2的質(zhì)量。

1.3.3 果酒酵母耐受性測定 分別以不同乙醇和pH值作為酵母菌生長和發(fā)酵的影響因素，通過測定發(fā)酵24 h后發(fā)酵液的OD600值，比較14株釀酒酵母在不同影響因素中的耐受性[13]。

1.3.4 果酒酵母產(chǎn)GSH能力測定 將種子液以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于pH 3.5和pH 6.5的搖瓶培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min搖床中振蕩培養(yǎng)48h，測定生物量、酵母發(fā)酵液及胞內(nèi)GSH的質(zhì)量濃度。

1.3.5 果酒酵母發(fā)酵性能測定

1）果汁培養(yǎng)基調(diào)配

分別用蔗糖和1 mol/L的蘋果酸調(diào)節(jié)果汁糖度為 20°Brix，pH 值為 3.5。

2）蘋果酒發(fā)酵

取500 mL的三角瓶，加入400 mL蘋果汁，按5%的接種體積分?jǐn)?shù)接入酵母種子液，在25℃下恒溫發(fā)酵，發(fā)酵初期微晃瓶體，使附著在瓶壁的酵母脫落，在發(fā)酵過程中每天取樣測定理化指標(biāo)，當(dāng)渣完全沉淀且無氣泡產(chǎn)生時則認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。

1.4 測定方法

1.4.1 HPLC法測定發(fā)酵液中GSH質(zhì)量濃度

1）色譜條件：色譜柱：Athena C18-WP，流動相為0.05 mol/L pH 5.6醋酸鈉緩沖液和甲醇（V/V=90∶10），流速為 1.0 mL/min，紫外檢測波長 330 nm，進(jìn)樣量 20 μL，柱溫 40.0 ℃[14]。

2）樣品處理：取1 mL樣品，加入1 mL 10%三氯乙酸，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心8 min，沉淀蛋白質(zhì)。取1 mL上清液，加入0.5 mL 500 μmol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，混合均勻，加入20 μL純水，再加入0.5 mL 0.01 mol/L DTNB，振蕩均勻，室溫反應(yīng)5 min，再加入0.1 mL 7.0 mol/L磷酸溶液酸化，10 000 r/min離心8 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)行HPLC分析[14]。

1.4.2 菌體生物量測定 將25 mL菌體培養(yǎng)液倒于已知重量的干凈離心管中，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min后棄去上清液，并加入適量蒸餾水洗滌2次，置于干燥箱中在105℃下烘干至恒重，總質(zhì)量與離心管質(zhì)量量之差即菌體干重，由此計算培養(yǎng)液的菌體生物量。

1.4.3 胞內(nèi)GSH質(zhì)量濃度測定 取10 mL發(fā)酵液，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min后棄去上清液，收集菌體。加入適量蒸餾水洗滌2次后，加入10 mL 40%乙醇溶液，振蕩器混合均勻，室溫下抽提2 h，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min得上清液，稀釋后進(jìn)行HPLC測定[15]。

1.4.4 發(fā)酵液色度的測定 取果汁或果酒發(fā)酵液，于8 000 r/min下離心10 min，將上清液在420 nm波長處測定吸光度，以吸光度值表示色度[16]。

1.4.5 果酒理化指標(biāo)測定 還原糖、酒精度參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

甘油質(zhì)量濃度測定：高效液相色譜法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH對多酚褐變的抑制效果

以鮮榨蘋果汁為研究對象，以VC、L-cys及SO2為對照，探討GSH對多酚褐變的抑制效果，試驗結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，作為應(yīng)用最廣泛的化學(xué)添加劑，SO2表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用。但大量研究結(jié)果表明，SO2對人體健康會產(chǎn)生很大的危害，這一缺點在一定程度上限制了它的使用。VC的抑制褐變效果較差，VC極易氧化分解，又可與游離氨基酸反應(yīng)，生成色素，隨著時間的延長，反而會使色澤加深[18]。L-cys對蘋果汁的抑制效果稍優(yōu)于VC，但加入L-cys后，果汁中的氨基酸含量增加，加重了美拉德反應(yīng)，果汁顏色有變紅的趨勢，限制了L-cys的應(yīng)用。

圖1 不同抗氧化劑對鮮榨蘋果汁褐變的影響Fig.1 Effect of different antioxidants on browning degree of fresh apple juice

由圖可知，GSH對蘋果汁褐變的抑制效果僅次于SO2，且隨著濃度的增加，褐變度趨于線性降低。GSH由于含有巰基而具有還原性，可以抑制果汁及果酒褐變。在引起褐變的酶促氧化過程中，GSH對多酚氧化酶的活性有一定抑制作用，在一定程度上抑制了酶促氧化。GSH可結(jié)合酚類物質(zhì)氧化后生成的醌，形成無色的羥醌類物質(zhì)，降低了果汁及果酒的褐變度[18]。GSH作為一種具有抗氧化、清除自由基作用的天然酶促褐變抑制劑，可用其代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)抗氧化劑SO2用于蘋果汁及蘋果酒釀造生產(chǎn)。

2.2 高產(chǎn)谷胱甘肽果酒酵母的篩選

2.2.1 酵母菌株發(fā)酵力比較 酵母菌的發(fā)酵力是反映酵母對各種糖類的發(fā)酵能力的重要指標(biāo)。以CO2失重量為指標(biāo)衡量酵母菌的發(fā)酵速率，是衡量酵母產(chǎn)酒能力的一個重要指標(biāo)。14株釀酒酵母菌株發(fā)酵力結(jié)果見圖2，由圖可見，14株釀酒酵母的發(fā)酵能力有顯著差別，試驗菌株 Y1401、01、Y-18、06#的發(fā)酵力較強(qiáng)于其它菌株，且在第4天CO2失重量達(dá)到最大，之后趨于平緩。

圖2 不同酵母菌株發(fā)酵力Fig.2 Fermentation capacity of different yeasts

2.2.2 酵母菌耐乙醇能力比較 一般來說，酵母細(xì)胞的發(fā)酵能力與菌株對酒精的耐性成正相關(guān)。由圖3可知，不同酵母菌對乙醇的耐受性不同，隨著培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加，酵母菌發(fā)酵液的OD600值不斷降低，在乙醇濃度大于10%時，酵母細(xì)胞的生長受到了很大抑制。從整個變化趨勢來看，耐乙醇能力較強(qiáng)的酵母菌為 01、06#、Y1403、Y-18、02 菌株。

圖3 不同乙醇濃度下酵母的耐受性Fig.3 Tolerance ofyeastsunder differentethanol concentration

2.2.3 酵母菌pH耐受性 隨著培養(yǎng)基pH值的降低，14株釀酒酵母的生長能力整體呈下降趨勢，在pH 2.0～3.0之間，酵母菌的生長受到很大程度抑制，由于此范圍并不是蘋果酒釀造的最適pH范圍，所以不會對蘋果酒發(fā)酵產(chǎn)生不良影響，見圖4。Y-18對pH的耐受性較強(qiáng)，OD值的波動較平緩，這說明Y-18菌株對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)于其它菌株。

圖4 不同pH值下酵母菌的耐受性Fig.4 Tolerance of yeasts to pH

2.2.4 酵母菌產(chǎn)GSH能力分析 對14株釀酒酵母的生物量和產(chǎn)GSH能力進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同酵母菌產(chǎn)GSH能力有較大差別，且pH對發(fā)酵液中GSH的質(zhì)量濃度影響較大。pH是微生物生長的一個重要的環(huán)境條件，對微生物的生長、發(fā)育以及代謝過程都有很大的影響。當(dāng)細(xì)胞處于不正常的環(huán)境中時，出于保護(hù)自身的本能和抵御外界環(huán)境傷害的需要，細(xì)胞可能會對其代謝產(chǎn)物的合成和分泌做出調(diào)整。研究表明，GSH在微生物抵抗酸脅迫過程中具有積極作用[19]。蘋果酒發(fā)酵pH為3.2～4.2，當(dāng)酵母細(xì)胞遭遇低pH脅迫時，細(xì)胞能以增加GSH合成并向胞外分泌GSH的方式來響應(yīng)和抵御外界pH的不斷降低。

由表1可以看出，在pH 3.5條件下，酵母菌發(fā)酵液中的GSH質(zhì)量濃度顯著高于pH 6.5時的GSH質(zhì)量濃度，說明酸性環(huán)境刺激了酵母菌向胞外分泌GSH能力，而不同酵母細(xì)胞對外界環(huán)境的響應(yīng)能力差異較大。在pH 3.5條件下，發(fā)酵液中GSH質(zhì)量濃度及胞外胞內(nèi)GSH質(zhì)量濃度較高的菌株為Y-18、03、04#、01、02、RW、06#、07# 菌株，其中 Y-18 及 03菌株發(fā)酵液的GSH質(zhì)量濃度顯著高于其它菌株。目前，針對GSH胞外釋放的研究較少，促進(jìn)GSH向胞外分泌的方法主要有2種：脅迫控制及表面活性劑處理。冮潔[20]等研究發(fā)現(xiàn)，在加入0.3%Triton X-100后，胞外GSH質(zhì)量濃度最高可達(dá)到29.03 mg/L，但細(xì)胞生長受到了很大程度的抑制，釀酒酵母Y-18在未經(jīng)表面活性劑處理的條件下GSH胞外質(zhì)量濃度達(dá)到29.5 mg/L，表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性。

表1 不同酵母菌株生物量及GSH質(zhì)量濃度的比較Table 1 Comparison of biomass and GSH content among different yeast strains

綜合考慮酵母菌的發(fā)酵力、耐受性及產(chǎn)GSH能力，篩選釀酒酵母Y-18作為高產(chǎn)GSH的果酒酵母菌株，該菌株在蘋果酒發(fā)酵pH范圍內(nèi)有優(yōu)良的發(fā)酵性能，產(chǎn)GSH能力顯著強(qiáng)于其它菌株。

2.3 高產(chǎn)GSH果酒發(fā)酵蘋果酒的性能測定

2.3.1 發(fā)酵過程中還原糖、乙醇的變化 對Y-18菌株和4株發(fā)酵力或產(chǎn)GSH能力較強(qiáng)的對照菌03、04#、06#、02進(jìn)行蘋果酒發(fā)酵試驗，從圖5可以看出，酵母菌在前4 d還原糖量迅速下降，酒精分?jǐn)?shù)近似線性增長，主發(fā)酵進(jìn)行到第5天后還原糖量和酒精分?jǐn)?shù)趨于平緩。通過與對照菌株比較可以發(fā)現(xiàn)，03菌株發(fā)酵能力較弱，不適合蘋果酒發(fā)酵，而Y-18菌株的發(fā)酵度平緩，能更好地防止雜菌污染，發(fā)酵結(jié)束后酒精度達(dá)到11%左右，是優(yōu)良的酵母菌種。

圖5 發(fā)酵過程中的還原糖、酒精度變化曲線Fig.5 Curve of reducing sugar and alcohol concentration in fermentation

2.3.2 發(fā)酵過程中甘油質(zhì)量濃度的變化 甘油是酵母菌酒精發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物，具有甜味，可用于平衡酒中的酸感，增加口感復(fù)雜性，是高品質(zhì)果酒的重要成分。由圖6可知，酵母菌在第1天甘油質(zhì)量濃度迅速增加，之后波動較小。菌株Y-18發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中甘油質(zhì)量濃度為5.6 g/L，約為對照菌的1.5～2倍。研究表明，當(dāng)酵母細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境時，甘油被誘導(dǎo)合成以提高胞內(nèi)滲透壓，其對細(xì)胞中的酶和生物大分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行較大程度的保護(hù)。因此，發(fā)酵過程中能生產(chǎn)甘油的酵母通常具有一定的滲透壓耐受能力[21]。

圖6 發(fā)酵過程中的甘油質(zhì)量濃度變化曲線Fig.6 Curve of glycerin content in fermentation

2.3.3 發(fā)酵過程中色度的變化 在果酒發(fā)酵過程中，既有酶促褐變又有非酶促褐變。酶促褐變主要發(fā)生在果酒發(fā)酵的前期，參與酶促褐變的酶主要是多酚氧化酶（PPO），它能催化酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)易進(jìn)一步聚合形成黑色素。非酶促褐變主要有美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、抗壞血酸氧化分解反應(yīng)、多元酚氧化縮合反應(yīng)等[22]。

蘋果酒發(fā)酵液的色度變化如圖7所示。隨著發(fā)酵時間的推移，4株對照菌發(fā)酵液的色度呈先下降后趨于平緩的趨勢，Y-18菌株發(fā)酵液色度下降趨勢顯著。在發(fā)酵過程中，Y-18菌株發(fā)酵液的色度維持在較低水平，在第5天色度降低40.4%，發(fā)酵結(jié)束后色度顯著低于其余對照菌株。

圖7 發(fā)酵過程中的色度變化曲線Fig.7 Curve of color value in fermentation

2.3.4 發(fā)酵過程中GSH質(zhì)量濃度的變化 在蘋果酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中GSH質(zhì)量濃度處于動態(tài)變化中，GSH主要由酵母菌代謝產(chǎn)生，其參與發(fā)酵過程中的抗氧化過程，GSH可結(jié)合酚類物質(zhì)氧化后生成的醌，形成無色的羥醌類物質(zhì)，對果酒褐變的抑制及抗氧化性的提高影響顯著。由圖8可以看出，不同酵母菌發(fā)酵液的GSH質(zhì)量濃度各不相同，但趨勢較為一致，在第2天，GSH質(zhì)量濃度達(dá)到最高值。研究表明，不同酵母菌發(fā)酵的果酒GSH質(zhì)量濃度差異較大，Giuseppe[23]等對發(fā)酵結(jié)束的白葡萄酒中的GSH質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量濃度僅為0～2 mg/L，且隨著陳化時間的延長逐漸減少。Y-18菌株在發(fā)酵過程中發(fā)酵液的GSH質(zhì)量濃度最高可達(dá)14.39 mg/L，具有明顯的優(yōu)勢。發(fā)酵結(jié)束后Y-18菌株發(fā)酵蘋果酒的GSH質(zhì)量濃度為5.82 mg/L，顯著高于其它對照菌株。

圖8 發(fā)酵過程中的GSH質(zhì)量濃度變化曲線Fig.8 Curve of GSH content in fermentation

2.3.5 不同酵母菌發(fā)酵蘋果酒的感官特征

不同酵母發(fā)酵蘋果酒的感官分析見表2。

表2 不同酵母菌發(fā)酵蘋果酒感官分析Table 2 Organoleptic evaluation of the cider brewed by different yeast strains

3 結(jié)語

考察了GSH對多酚褐變的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，與常用護(hù)色劑 SO2、VC、L-cys相比，GSH 抑制蘋果汁褐變能力優(yōu)于VC和L-cys，是一種很強(qiáng)的還原劑。

以14株果酒酵母為備選菌株，比較了酵母菌的發(fā)酵力、耐酒精、耐pH能力，結(jié)果表明，菌株Y1401、01、Y-18、06# 的發(fā)酵力較強(qiáng)。 耐乙醇能力較強(qiáng)的酵母菌為 01、06#、Y1403、Y-18、02 菌株。pH 是微生物生長的一個重要的環(huán)境條件，在pH 2.0～3.0之間，酵母菌的生長受到一定程度抑制，而Y-18菌株對pH的耐受性較強(qiáng)，對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)于其它菌株。

通過對14株釀酒酵母產(chǎn)GSH能力進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH 3.5條件下，酸性環(huán)境刺激酵母菌向胞外分泌GSH，發(fā)酵液中GSH質(zhì)量濃度及GSH質(zhì)量濃度較高的菌株為 Y-18、03、04#、01、02、YRW、06#、07#，其中Y-18及03菌株發(fā)酵液的GSH質(zhì)量濃度顯著高于其它菌株。綜合以上指標(biāo)，選擇Y-18作為高產(chǎn)GSH的果酒酵母菌株，用于蘋果酒發(fā)酵試驗。

本試驗對Y-18菌株和4株發(fā)酵力或產(chǎn)GSH能力較強(qiáng)的對照菌 03、04#、06#、02進(jìn)行蘋果酒發(fā)酵試驗。結(jié)果表明，Y-18菌株的發(fā)酵度平緩，發(fā)酵結(jié)束后酒精分?jǐn)?shù)達(dá)到11%左右，是優(yōu)良的酵母菌種。發(fā)酵過程中能生產(chǎn)甘油的酵母通常具有一定的滲透壓耐受能力，菌株Y-18發(fā)酵蘋果酒甘油質(zhì)量濃度為5.6 g/L，約為其它菌株的1.5～2倍。隨著發(fā)酵時間的推移，4株對照菌發(fā)酵液的色度呈先下降后趨于平緩的趨勢，Y-18菌株發(fā)酵液色度顯著低于其它菌株。而GSH質(zhì)量濃度在發(fā)酵過程中處于動態(tài)變化，在第2天達(dá)到最高值，Y-18菌株發(fā)酵液中GSH質(zhì)量濃度最高達(dá)14.39 mg/L。

綜上，GSH對抑制多酚褐變具有較好的效果，而高產(chǎn)GSH果酒菌株Y-18能在降低果酒褐變值的同時保持良好的發(fā)酵特性，在提高果酒安全性的前提下利用生物方法減少褐變對果酒品質(zhì)的影響，從而為高品質(zhì)果酒的開發(fā)提供新的思路和參考。