萬清廉

基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI- TOF MS)能夠有效的發(fā)現(xiàn)和檢驗血清等體液中腫瘤標記物[1-3]，具有高通量，微上樣量，適合大樣本檢測等特點。弱陽離子蛋白芯片(WCX磁珠)能夠提純血清蛋白。許多研究表明：低分子量蛋白片段，特別是分子量小于20 kD，能夠提供新的診斷癌癥和其他疾病的檢驗方法[4-6]。食管癌(esophageal cancer)是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一[7]，也是中國最高發(fā)的惡性腫瘤之一，高居中國惡性腫瘤死因中的第四位[7-8]。以手術(shù)為主的術(shù)前術(shù)后進行放化療綜合治療，已成提高患者生存期的有效手段。化療后患者血清蛋白是否有變化，意義如何，本研究旨在聯(lián)合應(yīng)用WCX磁珠和MALDI- TOF MS檢查，及ClinProt 2.2軟件和SNN方法建立食管癌手術(shù)后、化療后患者診斷模型，比較其變化，探討化療對食管癌術(shù)后患者相關(guān)蛋白質(zhì)表達譜的影響。

1 資料與方法

1.1 病例分組

患者均為2015年1月至2016年1月間鄭州人民醫(yī)院胸外科住院患者，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為食管鱗狀細胞癌?；煼桨福憾辔魉?5mg/m2·d1，順鉑75mg/m2·d1，5-氟尿嘧啶750 mg/m2·d1～5，q21d。健康志愿者血清資料由中國人民解放軍150中心醫(yī)院檢驗中心實驗室提供。詳細臨床資料見表1。所有患者都享有知情權(quán)并簽字同意參與采血，且經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。各組患者均清晨空腹采靜脈血5 ml，并于4 ℃冰箱靜置30 min，然后3 000 r/min離心機離心10 min，取上層血清約1 ml植于J管內(nèi)，樣本保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。所有試驗設(shè)計標本收集齊全后，液氮罐保存樣本到中國人民解放軍150中心醫(yī)院檢驗中心實驗室進行試驗。

表1 食管癌術(shù)后、化療后患者及健康對照組臨床資料

注：實驗組與對照組間年齡，性別比較，P>0.05。

1.2 試驗儀器及方法

德國Brucker Daltonics公司提供WCX磁珠和AutoflexⅢ型質(zhì)譜儀及標準血清peptide和protein混合物。試驗中為去除血清中高豐度蛋白的影響，利用WCX磁珠進行血清蛋白提純，方法同參考文獻[6]。樣品混勻后行質(zhì)譜分析。用已知相對分子質(zhì)量的標準品進行誤差校正。樣品隨機點樣于384拋光靶，每8個樣品加一個標準血清控制實驗流程質(zhì)量。先點1 μl樣品，室溫干燥后，再點1 μl基質(zhì)(3 mg/ml)CHCA，50%，CAN，2%TFA)，室溫干燥后上機檢測。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用ClinProt線性陽離子模式，參數(shù)如下：第1離子源20 KV，第2離子源18197 KV，檢測蛋白質(zhì)范圍0～20 000 Da。每份樣品點4個靶點，對于不同結(jié)晶點，多點采集，每個點200shots，選10個不同位置累計2000shots。先用高能量激光轟擊，再換成低能量激光采集圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)的處理與分析

采用ClinProt Model系統(tǒng)分析，其中數(shù)據(jù)包括Recognition Capability表示分組準確率，100%最好。Intergration Regions used for Classification：說明模型所用的質(zhì)譜峰，Weight表示權(quán)重，值越大表示在模型中越重要；2D PEAK Distribution：紅綠色表示兩個組的數(shù)據(jù)分布，沒有重疊表示模型質(zhì)量好。Box D：選擇的都是在分組準確率達到100%的某個建模方法所用到的質(zhì)譜峰(分子量表示)，表示某組里某個分子量峰面積分布的箱體圖，橫坐標為分組，縱坐標為峰面積或強度，右上角注明相應(yīng)的分子量。ROC D：選擇的都是在分組準確率達到100%的某個建模方法所用到的質(zhì)譜峰(分子量表示)，表示某組里某個分子量的檢驗效能(接收者工作曲線)，橫坐標為特異性，縱坐標為靈敏度，文字表示信息包括峰的分子量，AUC表示曲線下面積，值越接近1，表示其檢驗效能越好。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(SNN)算法運算建立實驗組診斷模型，66例樣本隨機劃分，80%作為訓(xùn)練組，20%作為盲法組，驗證診斷模型的特異度和靈敏度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0數(shù)據(jù)包t檢驗分析臨床資料，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。ClinProt 2.2軟件包處理。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后組和健康對照組檢測的蛋白質(zhì)荷比峰情況

檢測出術(shù)后組和健康對照組相對分子質(zhì)量在0～20000范圍內(nèi)的所有蛋白質(zhì)荷比峰，對每一個質(zhì)荷比峰做成組數(shù)據(jù)比較，共檢測出113個蛋白峰(P<0.01)，峰有49個。其中有8個上調(diào)峰和41個下調(diào)峰，應(yīng)用ClinProt 2.2軟件包，用過SNN運算，最終篩選出1個差異顯著的蛋白質(zhì)荷比峰(m/z 676.61)建立診斷模型。

2.2 術(shù)后化療組和健康對照組檢測的蛋白質(zhì)荷比峰情況

檢測出食管癌術(shù)后化療組和健康對照組相對分子質(zhì)量在0～20 000范圍內(nèi)的所有蛋白質(zhì)荷比峰，對每一個質(zhì)荷比峰做成組數(shù)據(jù)平均數(shù)比較，共檢測出105個蛋白峰(P<0.01)，峰有58個。其中有8個上調(diào)峰和50個下調(diào)峰，利用ClinProt 2.2軟件包，用過SNN運算，最終篩選出1個差異顯著的蛋白質(zhì)荷比峰(m/z 676.46)建立診斷模型。

2.3 術(shù)后化療組和術(shù)后組蛋白質(zhì)荷比峰情況

檢測出食管癌術(shù)后組與食管癌術(shù)后化療組血清蛋白相對分子質(zhì)量在0～20 000范圍內(nèi)的所有蛋白質(zhì)荷比峰，建立診斷模型，手術(shù)后化療組蛋白質(zhì)荷比峰(m/z 3951.77，2661.11，823.61，824.08，5907.51，6670.7，4266.81，810.47，4965.26，1519.3，849.63，1466.09，1617.58，1467.16，758.8)，分組正確率為100%。

3 討論

以手術(shù)為主的術(shù)前術(shù)后進行放化療綜合治療，已成提高患者生存期的有效手段。術(shù)后輔助化療的機制是消除根治性手術(shù)后殘留在食管癌患者體內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移灶，預(yù)防其局部復(fù)發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移。毛偉敏等[9]的Meta分析比較了手術(shù)并輔助化療與單純手術(shù)的療效，文獻結(jié)果表明，輔助化療可延長患者的3年無進展生存(RR 1.225;95%CI 1.012～1.482;P=0.037)，但并未提高患者的3年、5年生存率。Emi等[10]研究表明，多西他賽/順鉑/氟尿嘧啶聯(lián)合放療，進行術(shù)前新輔助放化療，耐受性好，治療總有效率86%(完全緩解57%，部分緩解29%)，有更高的病理完全緩解率，值得臨床進一步研究。該項研究結(jié)果與Eisterer等[11]進行的Ⅱ期臨床研究結(jié)果相似，提示該方案進行新輔助治療，是安全、可行、有效的。近5年來國內(nèi)有多名作者利用MALDI-TOF MS方法來篩選不同腫瘤的腫瘤標記物，取得了一系列研究成果。諸如：賁門癌[12]，胃癌[13]，大腸癌[14-15]，肝癌[16]，非小細胞肺癌[17]等，食管癌[18-20]的相關(guān)診斷模型已有多篇，但鮮見有同期行手術(shù)后、化療后診斷模型的建立，以及它們之間相互關(guān)系的研究。

本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS 的ClinProt和WC磁珠分選技術(shù)檢測食管鱗癌手術(shù)后、化療后患者和健康對照組血清標本，其目的是建立診斷模型。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得出食管癌術(shù)后組(m/z676.61)、化療后(m/z676.48)，上述斷模型的特異度100%和靈敏度100%。劉會寧等[21]應(yīng)用ELISA 分析出食管癌患者體內(nèi)Reg Iet 蛋白表達水平明顯升高，且隨著食管癌的切除而下降，這表明某些異常的蛋白表達與食管癌明確相關(guān)。王立東等[22]的研究也提示這些異常表達的蛋白與腫瘤預(yù)后呈正相或負相關(guān)，并且其中一些蛋白可能參與了食管癌發(fā)生發(fā)展過程。術(shù)后化療后組與術(shù)后組比(m/z 3951.77，2661.11，823.61，824.08，5907.51，6670.7，4266.81，810.47，4965.26，1519.3，849.63，1466.09，1617.58，1467.16，759.8)，分組正確率為100%?；煂颊哐宓鞍讏D譜有顯著影響，說明化療后使某些與腫瘤相關(guān)的蛋白上調(diào)(m/z 3951.77，6670.7，810.47，849.63，758.8)，以及下調(diào)(m/z 5907.51，2661.11，823.61，824.08，4266.81.4965.26，1519.3，1466.09，1617.58，1467.16)，這一觀點與周峰等[23]觀點相同，放化療治療后使某些與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)表達下調(diào)，將至正常人的水平，在圖譜上顯示其峰強度與正常對照組基本相當?；煂?dǎo)致了血清蛋白變化，其發(fā)生機制不清楚，有待于進一步研究。經(jīng)過篩選所得到的蛋白質(zhì)峰能作為食管癌術(shù)后以及化療后標志物，其靈敏度和特異度高，對預(yù)后判斷分析具有一定臨床意義。