鄭香偉

原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為臨床較為常見腫瘤，隨著社會發(fā)展，人們生活方式和飲食習慣發(fā)生了很大改變，HCC發(fā)病率也呈逐漸升高趨勢，對患者及家庭帶來了沉重的心理壓力和經濟負擔[1-2]。當前，對肝癌患者唯一治愈性的治療方法為肝移植，但在實際臨床中不能切除與晚期患者比例超過了80%，這些患者不能就進行手術切除后者肝移植。常規(guī)化療對晚期患者有一定幫助，但高復發(fā)率和嚴重毒副作用，使晚期患者生存時間也僅保持在半年上下，因此，尋找新的治療與檢測方法對肝癌患者顯得十分重要。Ohta等在1996年首次提出抑癌基因脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine teiad，F(xiàn)HIT)，其在多數(shù)正常臟器內存在，它能夠經過阻滯細胞生長周期與誘導細胞凋亡來起到抑癌影響。P16為近些年來發(fā)現(xiàn)1種新的多腫瘤抑制基因，相關研究顯示，P16蛋白為預測HCC患者預后狀況的主要指標[3-4]。因此，本文通過分析FHIT及P16兩種因子在肝癌發(fā)生發(fā)展過程臨床意義，為HCC患者檢測及治療提供一些借鑒。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年6月至2017年6月間在本院進行手術肝癌患者148例，標本手術后使用鹽水沖洗，清除血污和壞死組織，在10%福爾馬林保存，完成包埋與切片。男性患者102例，女性患者46例，平均年齡(48.3±8.4)歲，腫瘤大?。骸? cm 52例，<5 cm 96例；TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期88例，Ⅲ期、Ⅱ期60例；分化程度：低分化54例，中分化64例，高分化30例；38例形成門靜脈癌栓，46例有淋巴結轉移。

分組：選取標本離切除的肝癌組織1～2 cm為癌旁組織組，90例；選取標本離切除的肝癌組織≥5 cm為遠肝癌組織組，90例；選取手術的切除標本為肝癌組織組，148例。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：冰箱(型號：KG23N1116W，由德國西門子公司生產)，顯微鏡(型號：CX31，由日本奧林巴斯公司生產)，溫箱(型號：ZK-Ⅰ，由揚州盛凱化工公司生產)，實驗分析系統(tǒng)(型號：Biosens Digital Imaging System v1.6，由上?？蒲袃x器廠生產),干燥箱(型號：FYL-YS-431L，由北京福意電器公司生產)，圖像采集系統(tǒng)(型號：Q5501W，由德國萊卡公司生產)。

試劑：FHIT及P16兔多克隆抗體(由上海微蒙酶聯(lián)公司生產)，二甲苯、蘇木精、中性樹膠、無水乙醇、DAB顯色試劑盒及SP9000試劑盒(由北京中杉生物公司生產)。

1.3 實驗方法

免疫組化SP法：放置恒溫烤箱內1 h，脫蠟、水化后抗原高壓修復，H2O23%滴入切片內孵育8 min將內源性的過氧化物酶封閉，山羊血清滴入將內源性生物素封閉；而后依次加入稀釋P16與FHIT兔多克隆抗體，PBS洗滌兩次后加入卵霉鏈白素和山羊抗兔IgG，DAB顯色、蘇木精復染、酒精脫水后使用中性樹膠封片，最后鏡檢。

對照組：陽性對照組為P16與FHIT乳腺癌陽性片，陰性對照組為正常兔IgG血清。

SP染色蛋白定位：P16與FHIT蛋白定位于胞質內，陽性結果：胞質染色為棕黃色或者棕褐色。

陽性判定：10個視野內陽性細胞量≥10%判定為陽性，反之判定為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 P16與FHIT蛋白表達與定位狀況

P16蛋白定位在細胞核與胞質內，SP染色后表征是棕黃色或者黃色；FHIT蛋白定位在細胞胞質內，SP染色后表征是棕黃色或者黃色。

2.2 P16與FHIT蛋白在遠癌組織、癌旁組織與肝癌組織內表達情況

遠癌組P16及PHIT蛋白呈強陽性表達，高于癌旁組和肝癌組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，癌旁組P16及PHIT蛋白陽性表達高于肝癌組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 P16與FHIT蛋白在3組癌組織內陽性表達情況(例，%)

注：a為P<0.05，表示與肝癌組比較，b為P<0.05，表示與癌旁組比較。

2.3 P16與FHIT在三組組織標本內灰度值比較

P16與FHIT蛋白在肝癌組、癌旁組及遠癌組內灰度值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 P16與FHIT在三組組織標本內灰度值狀況比較

2.4 三組標本內P16與FHIT蛋白表達相關性

經Pearson相關分析，三組標本內P16與FHIT蛋白表達都呈正相關關系。

2.5 P16與FHIT陽性表達與肝癌臨床病理資料的關系

肝癌患者中P16蛋白陽性表達與其分化程度、腫瘤大小有關(P<0.05)，F(xiàn)HIT陽性表達與其分化程度、TNM分期、形成門靜脈癌栓及淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表3。

表3 P16與FHIT陽性表達與肝癌臨床病理資料的關系/例

3 討論

肝癌發(fā)病機制當前尚不完全明確，主要包含遺傳、病毒感染、飲食與環(huán)境等多因素相關互相作用，而抑癌基因表達缺失及癌基因過度表達等造成細胞凋亡與增殖失去平衡在患者發(fā)病進展有重要影響[5-6]。

FHIT定位在14.2染色體區(qū)域內，約占1Mb位置，覆蓋HPV16整合位點、FRA3B腎細胞的相關斷裂點、脆性位點及抑癌基因PTPRG末端。其基因cDNA全長約1095bp，包含10個外顯的子結構序列。FHIT蛋白定位于細胞質，有147個氨基酸構成，F(xiàn)HIT基因進行編碼，該蛋白的空間結構與氨基酸序列和HIT蛋白相似度非常高[7-9]。FHIT蛋白對mRNA特殊結構發(fā)生影響，進而對重要mRNA翻譯能力起作用，造成脫帽能力缺損，而改變可能會加速腫瘤發(fā)生與進展[10-12]。關于FHIT過度表達在小細胞肺癌細胞抑制活性實驗顯示，p53與FHIT結合將PRIMA-1Met激活，可使生長抑制狀況達到高峰，小細胞肺癌治療中FHIT當做潛在治療基因，其能是抑制p53能力恢復[13-15]。近期一項研究顯示，肝癌細胞周期和凋亡調控中也有FHIT參與。P16蛋白為P16基因表達產物，Koerber等研究顯示肛門患者進行P16蛋白檢查對其長期生存率和治療結果有較大影響，P16蛋白的表達產物對腫瘤轉移與增值有抑制作用。Lim等在胃癌患者治療中發(fā)現(xiàn)，進行改良手術和淋巴結清掃患者手術后其血清內P16基因甲基化顯著降低，而P16表達產物則上升，對未行淋巴結清掃者生存期更長[16-18]。本文研究顯示，遠癌組組織內FHIT、P16陽性表達最強，而且隨著HCC病情進展，蛋白缺損狀況愈嚴重，胞漿內FHIT及P16蛋白表達量也逐漸下降，其和肝癌患者臨床資料狀況對比顯示，F(xiàn)HIT陽性表達在分化程度、TNM分期、形成門靜脈癌栓及淋巴結轉移方面差異有統(tǒng)計學意義，P16蛋白陽性表達在分化程度、腫瘤大小方面差異有統(tǒng)計學意義，說明HCC發(fā)病進展和FHIT、P16有密切聯(lián)系，可作為HCC患者診斷、治療及預后判別中重要指標。

綜上所述，P16和FHIT基因可抑制肝癌患者機體內癌細胞的生長與增值，且兩種因子呈正相關關系。