高艷梅 楊怡萍 慕玉東 張永彤 李 濤 王亞麗 高徳英 馬 莉

食管癌是1種比較常見的惡性腫瘤，在臨床上被發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)患者已為中晚期[1]。對(duì)食管癌患者進(jìn)行放射治療時(shí)，往往未考慮患者對(duì)放療的敏感性存在差異，導(dǎo)致實(shí)際療效和放療前預(yù)測(cè)結(jié)果差距很大。針對(duì)每位患者采用更合理的個(gè)體化放療方案，需要在放療前對(duì)食管癌患者的放射敏感性作出準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，而基因突變是引發(fā)多數(shù)腫瘤的重要原因，且這些基因及其表達(dá)的蛋白中的一部分蛋白又與放射治療的敏感性有關(guān)，所以本研究擬探討食管癌患者放療前EGFR,XRCC3及hOGG1表達(dá)情況，分析其與食管癌放射敏感性的關(guān)系，為EGFR,XRCC3及hOGG1在食管癌患者放射治療中的價(jià)值作出評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集陜西省腫瘤醫(yī)院放療中心2012年6月至2014年6月期間收治的食管癌患者，共50例，均通過病理檢查確診，年齡18～72歲，男性34例，女性16例?；颊哳A(yù)期的生存期大于3個(gè)月；患者為入組時(shí)拒絕手術(shù)或不宜手術(shù)的食管癌初治患者,并知情同意；無放療禁忌，所有患者KPS評(píng)分均≥70分。所有患者均于放化療前常規(guī)胸部CT掃描,腹部B超或CT掃描,血常規(guī),肝腎功電解質(zhì)檢查。利用食管鏡的方法從腫瘤組織獲取標(biāo)本，然后用10%的甲醛進(jìn)行固定，固定好的標(biāo)本用石蠟包埋，用切片機(jī)制成5 μm的切片備用。另取20例胃鏡下正常食管黏膜為對(duì)照。

1.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)

利用食管鏡的方法從腫瘤組織獲取標(biāo)本，然后用10%的甲醛進(jìn)行固定，固定好的標(biāo)本用石蠟包埋，利用切片機(jī)制成5 μm厚的切片。同時(shí)用PBS作為陰性對(duì)照，已知的EGFR,XRCC3和hOGG1陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。步驟：①備用的石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化；②去離子水沖洗，并在PBS中浸泡5 min，利用微波抗原進(jìn)行修復(fù)；③在切片中加入100 μl的3% H2O2溶液在室溫孵育10 min，利用PBS洗滌3次，每次2 min的方式去除內(nèi)源性過氧化物酶活性；④分別加入EGFR,XRCC3和hOGG1單克隆抗體，在室溫下孵育2 h，用PBS洗滌3次，每次2 min；⑤加入工作液，在室溫下孵育2 min，用PBS洗滌3次，每次2 min；⑥加入DAB顯色劑進(jìn)行顯色；⑦在水下充分沖洗，蘇木精進(jìn)行復(fù)染，二甲苯進(jìn)行透明化處理，梯度酒精進(jìn)行脫水，最后用中性的樹脂進(jìn)行封固，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 放射治療

按2009年提出的非手術(shù)治療食管癌專家組的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行分期,接受6MV-X電子直線加速器射線進(jìn)行三維適形放射治療或調(diào)強(qiáng)放療，放射治療設(shè)計(jì),GTV為CT掃描所見,結(jié)合食管鋇餐造影及胃鏡檢查所見原發(fā)腫瘤及區(qū)域腫大淋巴結(jié),CTV為GTV周圍0.6～0.8 cm區(qū)域,包括GTV及臨近區(qū)域,相應(yīng)淋巴引流區(qū),腫瘤上下外擴(kuò)3 cm正常食管組織,PTV為CTV基礎(chǔ)上外擴(kuò)0.5 cm,常規(guī)分割劑量為2.0 Gy/次，5次/周。靶區(qū)劑量60～66 Gy。

1.4 結(jié)果判定

近期療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤完全消失，X線片看食管邊緣光滑，順利通過鋇劑，管壁稍微僵硬，管腔稍微狹窄或者狹窄消失，基本恢復(fù)到正常的管腔或者稍微變寬判定為完全緩解(CR)；病變消失大部分，沒有出現(xiàn)明顯的角或扭曲，未出現(xiàn)腔外潰瘍，鋇劑尚可以順利的通過，X線片看食管邊緣不是特別光滑，有一些小完影或者充盈缺損，還有一些邊緣雖然光滑，但是管腔會(huì)有明顯的狹窄判定為部分緩解(PR)；病變沒有明顯的好轉(zhuǎn)或者病變部位有殘留，在X線片看仍可以看到管腔狹窄或者管腔充盈缺損判定為無緩解(NR)。

免疫組織結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：EGFR蛋白在細(xì)胞膜和胞質(zhì)呈棕褐色為陽(yáng)性，XRCC3蛋白在細(xì)胞核內(nèi)沉著為棕黃色顆粒為陽(yáng)性，hOGG1蛋白在線粒體和細(xì)胞核內(nèi)沉著為棕黃色顆粒。以陽(yáng)性細(xì)胞占癌細(xì)胞的不同比例進(jìn)行判定，無陽(yáng)性細(xì)胞的判定為陰性(-)；陽(yáng)性細(xì)胞占癌細(xì)胞總數(shù)的比例≤10%為輕度陽(yáng)性(+)；比例>10%～50%為中度陽(yáng)性(++);>50%的為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。不同級(jí)別的陽(yáng)性細(xì)胞都為陽(yáng)性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用χ2檢驗(yàn)概率的比較，指標(biāo)間相關(guān)分析應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)，當(dāng)P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中EGFR、XRCC3和hOGG1表達(dá)及相關(guān)性分析

20例正常食管黏膜中EGFR均為陰性表達(dá)，XRCC3陽(yáng)性表達(dá)2例，hOGG1陽(yáng)性表達(dá)1例。50例食管癌組織中，EGFR陽(yáng)性表達(dá)36例，陽(yáng)性率為72.0%；XRCC3陽(yáng)性表達(dá)34例，陽(yáng)性率為68.0%；hOGG1陽(yáng)性表達(dá)32例，陽(yáng)性率為64.0%。利用Spearman相關(guān)分析三者之間兩兩呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),其中EGFR和XRCC3兩兩正相關(guān)(γ=0.345,P<0.05)；EGFR和hOGG1呈正相關(guān)(γ=0.436,P<0.05)；XRCC3和hOGG1呈正相關(guān)(γ=0.524,P<0.05)，見表1。

表1 EGFR、XRCC3和hOGG1在食管癌組織中表達(dá)的關(guān)系/例

2.2 EGFR、XRCC3和hOGG1表達(dá)與食管癌放療近期療效的關(guān)系

50例食管癌患者均完成了放射治療，在整個(gè)治療期間所有患者均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。在放射治療過程的中期、放射治療結(jié)束時(shí)和放射治療后3個(gè)月進(jìn)行食管鋇餐造影X片檢查和CT胸部掃描來對(duì)患者的近期療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果為：完全緩解(CR)為8例(16.0%)，部分緩解(PR)為28例(56.0%)，無緩解(NR)為14例(28.0%)，總有效率(CR+PR)為72.0%。

EGFR陽(yáng)性表達(dá)患者有36例，進(jìn)行放射治療有效的有23例(63.9%)，EGFR陰性表達(dá)患者有14例，進(jìn)行放射治療有效的有12例(85.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.654，P=0.037)；34例XRCC3陽(yáng)性表達(dá)患者中放射治療有效的有20例(58.8%)，16例XRCC3陰性表達(dá)患者中放射治療有效的有13例(81.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.617，P=0.043)；hOGG1陽(yáng)性表達(dá)患者有32例，進(jìn)行放射治療有效的有21例(65.6%)，hOGG1陰性表達(dá)患者有18例，進(jìn)行放射治療有效的有16例(88.9%)；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.436,P=0.034)，如表2。

表2 EGFR、XRCC3和hOGG1表達(dá)與近期療效關(guān)系/例

2.2.1 EGFR和hOGG1聯(lián)合表達(dá)與食管癌放療近期療效的關(guān)系 50例食管癌患者中，EGFR和hOGG1共同陽(yáng)性表達(dá)者23例，其中13例放療有效，有效率56.5%；共同陰性表達(dá)的患者5例，全部放療有效，有效率100%。二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.045,P<0.05)。

2.2.2 EGFR和XRCC3聯(lián)合表達(dá)與食管癌放療近期療效的關(guān)系 50例食管癌患者中，EGFR和XRCC3共同陽(yáng)性表達(dá)者27例，放療有效16例(59.3%)；共同陰性表達(dá)的患者7例，其中6例放療有效，有效率85.7%。二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.213,P<0.05)。

2.2.3 XRCC3和hOGG1聯(lián)合表達(dá)與食管癌放療近期療效的關(guān)系 50例食管癌患者中，XRCC3和hOGG1共同陽(yáng)性表達(dá)者22例，其中14例放療有效，有效率63.6%；共同陰性表達(dá)的患者6例，其中5例放療有效，有效率83.3%。二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.325，P<0.05)。

3 討論

食管癌是臨床上常見的惡性腫瘤，但是在臨床上不容易發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)的時(shí)候一般已到中晚期。在臨床上放療是治療食管癌重要的方法之一，雖然進(jìn)行了一定的放射和生物學(xué)治療，但是治療效果并不理想，復(fù)發(fā)率高達(dá)80%。在臨床上放療后會(huì)出現(xiàn)腫瘤消退現(xiàn)象，但同時(shí)也會(huì)伴發(fā)放射性食管炎，研究表明產(chǎn)生這種差異的原因可能與食管癌的DNA損傷修復(fù)基因有關(guān)。在機(jī)體內(nèi)有多個(gè)DNA修復(fù)機(jī)制，機(jī)體內(nèi)任何一種損傷功能低下時(shí)，都不能及時(shí)修復(fù)損傷的DNA，從而有害的突變基因不斷積累，使發(fā)生腫瘤的可能性增加。EGFR、XRCC3、hOGG1是DNA損傷修復(fù)中比較重要的3種基因[2]。根據(jù)以前的文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，絕大部分的文獻(xiàn)報(bào)道這三種基因的表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致食管癌等一些腫瘤疾病的發(fā)生[5-6]。當(dāng)DNA損傷，XRCC1、hOGG1、XRCC3產(chǎn)生基因突變，修復(fù)功能發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。而在DNA水平的變化最終演變到蛋白水平的變化上，因此研究XRCCl、XRCC3及hOGGl這三種蛋白在食管癌放療過程中的表達(dá)及其與放療敏感性對(duì)腫瘤的發(fā)生具有重要意義。

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，是原癌基因c-erb(HER-1)表達(dá)的產(chǎn)物，可以調(diào)節(jié)機(jī)體生理狀態(tài)下的細(xì)胞分化和生長(zhǎng)。當(dāng)EGFR過表達(dá)或者發(fā)生突變時(shí)，細(xì)胞的增殖會(huì)不受控制以至于發(fā)生癌變[7]。有研究表明，當(dāng)食管癌的惡化發(fā)生和增加浸潤(rùn)度，EGFR的表達(dá)會(huì)逐漸增加。另外有研究報(bào)道[8]，EGFR過表達(dá)時(shí)食管癌在淋巴的轉(zhuǎn)移率會(huì)增加，研究結(jié)果還顯示EGFR的表達(dá)水平對(duì)患者的放射治療敏感性和預(yù)后康復(fù)情況有反映。研究表明EGFR可以干預(yù)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)而減弱放射線照射誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，導(dǎo)致降低患者的放療效果。有研究報(bào)道，把不同種類的鼠當(dāng)做食管癌的體內(nèi)模型進(jìn)行研究，結(jié)果表明EGFR的蛋白表達(dá)水平與放射治療的敏感性具有明顯的負(fù)相關(guān)。Ang等的研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部癌癥患者的EGFR的表達(dá)水平也與放射敏感性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究的結(jié)果與上述一致。

XRCC3作為Rad51旁系同源家族中的一種基因，可以對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的損傷的雙鏈DNA進(jìn)行同源重組修復(fù)[9]，其參與的這種同源重組過程可以維持細(xì)胞端粒的動(dòng)態(tài)平衡[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，在食管癌的組織和細(xì)胞中，XRCC3都有過表達(dá)現(xiàn)象，而且去干擾食管癌細(xì)胞的 XRCC3的表達(dá)，結(jié)果表明食管癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡通路中表達(dá)的蛋白PARP和Caspase-3增加，從而提高了食管癌細(xì)胞的凋亡率。這種研究結(jié)果表明食管癌細(xì)胞中XRCC3的表達(dá)的發(fā)生機(jī)制可能為XRCC3抑制了放射過程中的電離輻射作用產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡的過程，從而產(chǎn)生食管癌細(xì)胞抵抗放射治療作用。曾憲亮[12]的研究結(jié)果顯示：與正常黏膜組織相比，XRCC3在食管鱗癌細(xì)胞和組織中在 mRNA 水平和蛋白水平都呈現(xiàn)較高表達(dá)，單因素分析發(fā)現(xiàn) XRCC3 的表達(dá)與食管鱗癌患者的放療敏感性相關(guān)，高表達(dá) XRCC3 與患者放療抵抗有關(guān)(P=0.002)。

hOGG1是人體細(xì)胞中一種DNA氧化損傷修復(fù)關(guān)鍵酶，主要存在于細(xì)胞核，可以參與細(xì)胞核中的DNA修復(fù)。hOGG1基因在人群中存在基因多態(tài)性，當(dāng)某種基因突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致酶活性降低。張遵真等[13]選擇A549細(xì)胞作為他們實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，采用轉(zhuǎn)染hOGG1核酶的方法而得到低表達(dá)hOGG1蛋白的A549-R細(xì)胞，利用MTT法測(cè)定經(jīng)過射線照射后的這兩張細(xì)胞的存活率以及利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)這兩種細(xì)胞的增殖速率、凋亡率和周期分布。研究結(jié)果顯示，低表達(dá)hOGG1蛋白的A549-R細(xì)胞與正常A549細(xì)胞相比，其細(xì)胞增殖率和存活率明顯下降，而凋亡率增加，從而研究者得出低表達(dá)hOGG1蛋白可以增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。而產(chǎn)生這種現(xiàn)象原因可能是腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過射線照射后DNA發(fā)生損傷而難以修復(fù)，從而使細(xì)胞阻止在細(xì)胞分裂的G0/G1期。食管癌進(jìn)行放射治療時(shí)最大的問題就是腫瘤細(xì)胞的放射抗性，而hOGG1是DNA損失修復(fù)的一種關(guān)鍵酶，檢測(cè)hOGG1蛋白的表達(dá)情況為食管癌患者放療敏感性提供一定的預(yù)測(cè)[14]。

本研究表明，EGFR、XRCC3及hOGG1在食管癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性，而且EGFR、XRCC3及hOGG1的陽(yáng)性表達(dá)均與患者放療的近期療效呈負(fù)相關(guān)，陽(yáng)性者對(duì)放射不敏感，陰性者對(duì)放射敏感，聯(lián)合檢測(cè)三者中的兩者的聯(lián)合表達(dá)對(duì)放射敏感性的預(yù)測(cè)更具有重要意義。研究結(jié)果表明EGFR、XRCC3及hOGG1可作為反映食管癌放射敏感性和預(yù)測(cè)食管癌近期療效的重要指標(biāo)。在臨床工作中，通過檢測(cè)EGFR、XRCC3及hOGG1的表達(dá)可制定個(gè)體化的放療方案，同時(shí)為高表達(dá)患者應(yīng)用EGFR抑制劑或XRCC3抑制劑或抗hOGG1聯(lián)合放療提供一定的理論依據(jù)。