馬詩(shī)影

子宮內(nèi)膜癌是臨床上較為常見(jiàn)的婦科腫瘤疾病，其發(fā)病率高居第三，僅次于卵巢癌和宮頸癌，每年死于子宮內(nèi)膜癌的人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，子宮內(nèi)膜癌近年來(lái)成為了國(guó)內(nèi)外研究者的研究熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路研究，對(duì)于研究疾病發(fā)病機(jī)理，疾病藥物治療新靶點(diǎn)等方面具有非常重要的意義。NF-κB家族蛋白是近年來(lái)研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子，有報(bào)道表明[1-4]，NF-κB信號(hào)通路在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且與上述腫瘤患者疾病發(fā)展、侵入和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前NF-κB信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜癌中研究報(bào)道較少，本研究將選擇2014年1月至2017年1月于我院就診的120例子宮內(nèi)膜癌患者作為研究對(duì)象，探討NF-κB家族蛋白P65，P50及IκBα蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014年1月至2017年1月于我院就診的120例子宮內(nèi)膜癌患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為子宮內(nèi)膜癌；②患者均未進(jìn)行放療、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心理疾病、精神疾病患者；②合并慢性感染性疾病、心肺功能障礙、惡性腫瘤者或者其他重大疾病患者。根據(jù)FIGO病理分期進(jìn)行分組如下：Ⅰ期組(30例)、Ⅱ期組(32例)、Ⅲ期組(30例)和Ⅳ期組(28例)。同時(shí)選擇我院同期健康體檢者30例作為對(duì)照組。Ⅰ期組(30例)，男性14例，女性16例；年齡19～53(41.8±3.5)歲。Ⅱ期組(32例)，男性16例，女性16例；年齡19～52(41.8±3.3)歲。Ⅲ期組(30例)，男性14例，女性16例；年齡20～53(41.8±3.5)歲。Ⅳ期組(28例)，男性14例，女性14例；年齡19～55(42.8±3.5)歲。對(duì)照組(40例)，男性15例，女性15例；年齡19～55(43.8±3.5)歲。各組患者在性別、年齡等一般資料比較無(wú)明顯差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，資料具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα抗體購(gòu)自abcam公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自坦克拉公司；TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；基礎(chǔ)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(Thermo公司)；EL204-電子天平(上海特勒-托多利多儀器有限公司)；凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 RT-PCR檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平[5]

根據(jù)Trizol試劑盒提取組織總RNA，采用核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA純度和濃度，取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進(jìn)行定量檢測(cè)，NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα擴(kuò)增引物序列為如表1，擴(kuò)增條件及計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[6]。

表1 RT-PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)

1.4 Western blot檢測(cè)NF-κb信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平[7]

常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα(目的蛋白)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對(duì)條帶亮度進(jìn)行分析。

1.5 免疫組化[8]

采用常規(guī)方法制備5 μm厚的石蠟切片，進(jìn)行免疫組化染色，在10 mmol/l檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的熱激30 min介導(dǎo)抗原復(fù)性，采用抗NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα單克隆抗體孵育，4 ℃過(guò)夜。洗滌后孵育二抗，加顯色液后進(jìn)行曝光。根據(jù)染色強(qiáng)度(0～3分，0分為無(wú)染色，1分為弱染色，2分為中度染色，3分為強(qiáng)染色)進(jìn)行判分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)

與對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα mRNA表達(dá)水平均升高，且mRNA表達(dá)水平隨著子宮內(nèi)膜癌疾病嚴(yán)重程度的增加而升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 RT-PCR檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平

注：與對(duì)照組相比，*為P<0.05。

2.2 Western blot法檢測(cè)各組中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα 蛋白表達(dá)水平均升高，且蛋白表達(dá)水平隨著子宮內(nèi)膜癌疾病嚴(yán)重程度的增加而升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見(jiàn)表3和圖1。

表3 Western blot法檢測(cè)各組中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

注：與對(duì)照組相比，* 為P<0.05。

1為對(duì)照組，2為Ⅳ期組，3為Ⅲ期組，4為Ⅱ期組，5為Ⅰ期組。

2.3 免疫組化法檢測(cè)各組中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率

免疫組化結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα陽(yáng)性率均升高，且陽(yáng)性率隨著子宮內(nèi)膜癌疾病嚴(yán)重程度的增加而增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見(jiàn)表4。

表4 各組中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(例，%)

注：與對(duì)照組相比，*為P<0.05。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是臨床上最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，其具有較高的發(fā)病率和死亡率，每年死于子宮內(nèi)膜癌的人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，子宮內(nèi)膜癌近年來(lái)成為了國(guó)內(nèi)外研究者的研究熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路研究，對(duì)于研究疾病發(fā)病機(jī)理，疾病藥物治療新靶點(diǎn)等方面具有非常重要的意義。NF-κB家族蛋白是近年來(lái)研究較多的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB家族蛋白可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等息息相關(guān)。NF-κB是1類核轉(zhuǎn)錄因子，在非刺激狀態(tài)的時(shí)候，NF-κB與它的抑制物IκBα結(jié)合，此時(shí)NF-κB是以1種未被激活的形式，并且存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到損傷等條件的刺激后，與NF-κB結(jié)合的IκBα發(fā)生降解，NF-κB釋放并且被激活，最終轉(zhuǎn)移至胞核中參與調(diào)控各類相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，故NF-κB參與相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程[9-11]。NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα蛋白是常見(jiàn)的NF-κB家族蛋白成員。關(guān)于NF-κB家族蛋白與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外研究較少。Lin等[12]研究表明，NF-κB家族蛋白與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān)，抑制NF-κB的表達(dá)，可以改善子宮內(nèi)膜癌疾病。Mori等[13]研究結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜癌患者易高表達(dá)NF-κB，子宮內(nèi)膜癌的疾病嚴(yán)重程度和不良預(yù)后與NF-kB水平高表達(dá)息息相關(guān)。

本研究中，RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，且mRNA和蛋白表達(dá)水平隨著子宮內(nèi)膜癌疾病嚴(yán)重程度的增加而增加。免疫組化結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα 表達(dá)陽(yáng)性率均升高，且表達(dá)陽(yáng)性率隨著子宮內(nèi)膜癌的疾病嚴(yán)重程度的增加而增加。

綜上所述，NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白NF-κB P65，NF-κB P50及IκBα在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，并且上述蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為判斷子宮內(nèi)膜癌的疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)，研究NF-κB信號(hào)通路與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系，對(duì)于研究疾病發(fā)病機(jī)理，疾病藥物治療新靶點(diǎn)等方面具有非常重要的意義。