崔 雄 韓龍海

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，且逐漸年輕化，嚴(yán)重威脅我國(guó)女性生命安全[1-2]。研究表明，Wnt信號(hào)通路也在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)出一定的促癌作用[3-4]。Wnt2是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的1個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，且近年研究表明，Wnt2基因與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)，但對(duì)乳腺癌的相關(guān)研究報(bào)道較少，因此其與乳腺癌之間的關(guān)系也越來(lái)越受到重視[5]。本研究即探討Wnt2基因在乳腺癌組織中的表達(dá)情況及靶向抑制Wnt2基因表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、遷移和侵襲力的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2016年10月本院收治的68例乳腺癌患者作為研究對(duì)象，按全國(guó)乳腺癌病理協(xié)作組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織活檢確診，所有患者手術(shù)之前均未接受放化療及內(nèi)分泌等抗腫瘤藥物治療。所有患者平均年齡(46.57±2.15)歲；平均病程(7.52±2.53)年。病理分型：導(dǎo)管內(nèi)癌45例，單純癌18例，乳頭狀癌3例，大汗腺癌2例；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ42例，Ⅲ期6例。收集患者癌組織、癌旁組織(距癌組織2 cm以上)和正常組織，生理鹽水沖洗后用液氮進(jìn)行迅速冷凍后超低溫冰箱保存。另選取女性健康志愿者60例，平均年齡(47.23±2.32)歲。2組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)研究批準(zhǔn)且所有納入患者及家屬均知情同意。

1.2 材料

1.2.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2 主要試劑及儀器 人Wnt2 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)；胰蛋白酶(Bio SHARP公司)；Transwell小室(Millipore公司)；SP試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；兔抗人Wnt2多克隆抗體(武漢中美科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Wnt2表達(dá)量的測(cè)定 采集2組研究對(duì)象術(shù)前空腹靜脈血5 mL，離心取上清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存待檢；采用EILSA法檢測(cè)患者血清中Wnt2表達(dá)量。

取適量癌組織、癌旁組織和正常組織，用免疫組化法(IHC)測(cè)定組織中Wnt2陽(yáng)性表達(dá)情況：將保存的乳腺癌組織、癌旁組織和正常組織進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚約4 μm，采用經(jīng)多聚賴氨酸包被的載玻片進(jìn)行貼片，于60 ℃電熱保溫干燥箱內(nèi)干燥24 h。將切片浸于二甲苯中脫蠟，然后經(jīng)梯度酒精水化，3% H2O2封閉10 min，PBS洗滌；滴加一抗：用1∶100稀釋的兔抗人Wnt2多克隆抗體工作液孵育，放置于4 ℃冰箱過(guò)夜；次日棄去一抗，滴加二抗(HRP標(biāo)記的通用型IgG)，于37 ℃恒溫箱放置20 min；PBS洗滌后，加DAB工作液避光顯色3～5 min，蘇木精復(fù)染5 min，脫水至透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察顏色程度，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)顏色為0分、淺黃色為1分、深黃色為2分、棕褐色為3分；每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400)觀察陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%為0分、>10%～25%為1分、>25%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分作為IHC評(píng)分，0～4分為Wnt2低表達(dá)，5～12分為Wnt2高表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7用DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并接種于12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000將Wnt2的siRNA和陰性對(duì)照(NC)的siRNA分別轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，分別稱為Wnt2-siRNA組和NC-siRNA組，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.3 CCK-8法測(cè)定2組細(xì)胞的增殖能力 取2組細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后棄去培養(yǎng)基，加入不含F(xiàn)BS的不完全培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm值。

1.3.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定2組細(xì)胞的凋亡率 分別取2組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，4×105個(gè)/孔接種于6孔板，2 mL/孔，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h后1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞2次后，用1×Binding buffer洗1次，收集細(xì)胞，再加入100 μL 1×Binding buffer重懸，接著加入5 μL AnnexinV-APC室溫避光孵育15 min后，加入1 mL 1×Binding buffer，1 000 r/min離心5 min棄上清，再加200 μL 1×Binding buffer重懸，接著加入5 μL 7-AAD混勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定2組細(xì)胞遷移及侵襲能力 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取2組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)洗滌、消化，每組做3個(gè)重復(fù)，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用無(wú)FBS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取150 μL接種于Transwell小室的上室，含10% FBS的培養(yǎng)基600 μL接種于下室，培養(yǎng)12 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，95%甲醇固定20 min，PBS洗滌3遍后，結(jié)晶紫染色30 min，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，拍照并記數(shù)。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室外膜均勻涂抹50 μL纖維粘連蛋白，風(fēng)干后，再于內(nèi)膜涂抹30 μL Matrigel稀釋液，37 ℃過(guò)夜凝膠。取2組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)洗滌、消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用無(wú)FBS培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×106個(gè)/mL，其他步驟同上。于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況，拍照并記數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組血清中Wnt2含量比較

68例乳腺癌患者和60例健康志愿者血清Wnt2的含量分別為(10.56±3.62)ng/mL、(1.89±0.86)ng/mL，2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.049，P<0.01)。

2.2 不同組織中Wnt2的表達(dá)情況

乳腺癌組織中Wnt2陽(yáng)性細(xì)胞率、染色強(qiáng)度、IHC評(píng)分均高于癌旁組織和正常組織，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中Wnt2表達(dá)情況

2.3 2組細(xì)胞增殖能力比較

2組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h至96 h時(shí)的OD450 nm值逐漸升高，但Wnt2-siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h的OD450 nm值均顯著低于NC-siRNA組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 2組細(xì)胞增殖能力比較

2.4 2組細(xì)胞凋亡率比較

Wnt2-siRNA組細(xì)胞凋亡率為(8.56±0.52)%，顯著高于NC-siRNA組的(6.18±0.63)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.568，P<0.01)。

2.5 2組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

遷移能力比較：Wnt2-siRNA組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為(85.00±2.00)個(gè)，顯著少于NC-siRNA組的(142.00±4.00)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=98.727,P<0.01)。侵襲能力比較：Wnt2-siRNA組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)為(57.00±4.00)個(gè)，顯著少于NC-siRNA組的(89.00±4.00)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.818,P<0.01)。

3 討論

乳腺癌是我國(guó)女性高發(fā)惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年提升，臨床上多采用手術(shù)、放療等進(jìn)行治療，但會(huì)引起多種并發(fā)癥，影響患者生存質(zhì)量，乳腺癌致病機(jī)理尚未有統(tǒng)一結(jié)論，臨床上缺乏治療該病的靶向手段。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明血管新生、癌細(xì)胞增殖及侵襲力與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。

Wnts為相對(duì)分子質(zhì)量約40 000的分泌型糖蛋白，廣泛表達(dá)于各種組織中，通過(guò)與細(xì)胞表面、細(xì)胞外基質(zhì)的廣泛聯(lián)系發(fā)揮作用進(jìn)而對(duì)胚胎早期發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外界因素發(fā)生變化時(shí)會(huì)造成Wnts過(guò)度活化，進(jìn)而發(fā)生失調(diào)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育異常或形成腫瘤[6-7]。Wnt2是Wnt信號(hào)通路中的重要分子，Wnt信號(hào)通路在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤中已有研究，且均顯示其具有一定的促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。然而，Wnt2在相關(guān)腫瘤以及乳腺腫瘤中的作用研究報(bào)道相對(duì)較少。研究表明[8-9]，Wnt2能通過(guò)多種分泌途徑誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變；食管癌腫瘤纖維母細(xì)胞可大量分泌Wnt2，進(jìn)而通過(guò)激活Wnt2-β連環(huán)蛋白信號(hào)通路，最終促進(jìn)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)。郭變琴等[10]研究表明，乳腺癌組織中Wnt2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于配對(duì)癌旁乳腺組織。本研究首先對(duì)68例乳腺癌患者及健康志愿者進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)Wnt2含量，結(jié)果顯示68例乳腺癌患者和60例健康志愿者血清Wnt2含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外IHC研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中的Wnt2陽(yáng)性細(xì)胞率、染色強(qiáng)度、IHC評(píng)分均高于癌旁組織和正常組織，部分揭示W(wǎng)nt2基因的高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。

臨床研究[11]顯示W(wǎng)nt2的過(guò)表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲潛能、腫瘤分期、臨床分級(jí)呈正相關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移是造成患者惡性程度升高的關(guān)鍵原因，腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移是1種復(fù)雜、連續(xù)的多步驟過(guò)程，腫瘤細(xì)胞具有從原發(fā)部位脫離并在遷移到轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行增殖的能力，不僅與細(xì)胞自身改變相關(guān)，也與腫瘤細(xì)胞及宿主微環(huán)境間的相互作用密切相關(guān)。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞等腫瘤模型中，靶向干擾Wnt2表達(dá)后抑制了腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Wnt2參與腫瘤的發(fā)展[12]。徐衛(wèi)燕等[13]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Wnt2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織和正常組織，Wnt2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力和黏附率均高于Wnt2低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞。由此可見，Wnt2參與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，因此Wnt2或可成為靶向治療乳腺癌的新目標(biāo)。本研究中采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率，并進(jìn)行Transwell小室侵襲/遷移實(shí)驗(yàn)，采用與天然基底膜極為相似的基質(zhì)膠鋪在Transwell小室膜上，有效地在體外模擬腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程。結(jié)果顯示，Wnt2-siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h的OD450 nm值均顯著低于NC-siRNA組，組間差異顯著。Wnt2-siRNA組細(xì)胞凋亡率為(8.56±0.52)%，顯著高于NC-siRNA組的(6.18±0.63)%。Wnt2-siRNA組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)顯著少于NC-siRNA組。提示靶向抑制Wnt2基因表達(dá)能有效地降低MCF-7乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的能力。

綜上所述，乳腺癌組織中Wnt2的表達(dá)顯著增加，靶向抑制Wnt2基因后能夠降低乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，增加其凋亡能力，部分揭示W(wǎng)nt2與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，為乳腺癌的治療提供靶向目標(biāo)。