李 暉 駱志國

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，其中以非小細胞肺癌為多見，約占肺癌所有病例的80%～85%。由于肺癌具有很強的侵襲遷移能力，所以是惡性腫瘤較高的腫瘤之一，且具有多種多樣的生物學特性[1-2]。現(xiàn)有大量的研究證實Caspase3是一切凋亡信號傳導的共同通路，前期查閱大量文獻未見有杜仲通過激活caspase3途徑來誘導腫瘤細胞凋亡的相關報道[3-4]。此外，雖然有證據(jù)表明在非小細胞癌中Caspase3可通過切斷PARP途徑，裂解DNA引起細胞凋亡，對抗Surivin基因抑制凋亡作用從而誘導腫瘤細胞凋亡[5-7]，但國內(nèi)外關于EPO通過激活caspase3途徑抑制肺癌細胞侵襲的研究亦未見報道。本研究中一是研究杜仲總多糖(EOP)對Lewis肺癌小鼠LLC細胞體外生長的抑制作用：檢測EOP、CDDP對LLC及KMB-17的細胞毒作用，證明其能否抑制肺癌細胞生長。二是探討杜仲總多糖(EOP)抑制Lewis肺癌小鼠LLC細胞的可能作用機制：檢測EOP、CDDP作用LLC細胞前后細胞中Caspase3 mRNA表達水平和蛋白表達水平的變化，證明其是否通過激活Caspase3 途徑誘導肺癌細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞株試劑與儀器

1.1.1 細胞株 小鼠Lewis肺腺癌LLC細胞株和人胚肺組織KMB-17二倍體細胞株購于西安交通大學。

1.1.2 主要試劑 caspase3 抗體(兔抗人多克隆抗體，NEB 原裝)，pYSTAT3 抗體(兔抗人多克隆抗體，PharMigen 原裝)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號：22400-071)，PBS(江蘇恒瑞)。

1.1.3 主要實驗儀器 流式細胞儀(美國BD公司)；CO2培養(yǎng)箱、漩渦振蕩儀(美國Thermo公司)；高速低溫離心機(德國Ependoff公司)；倒置光學顯微鏡(奧林巴斯)；酶標儀(北京伯輝生物科技有限公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀、垂直電泳槽(杭州匯爾儀器設備有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將凍存的LLC細胞和KMB-17細胞從-150 ℃冰箱取出，37 ℃水浴鍋中快速融解后，用75%酒精消毒，在超凈工作臺中移至干凈的15 ml離心管中，補充9 ml新鮮的1640培養(yǎng)基。3 000 r/min，離心10 min。棄掉培養(yǎng)基，加入5 ml新鮮的1640+10%FBS懸浮沉淀，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)基變黃后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(MTT) 比色法測定EOP和CDDP抑制LLC、KMB-17細胞生長的最佳作用濃度 選擇細胞狀態(tài)良好的LLC和KMB-17細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μl，鋪板使待測細胞調(diào)密度至1×104/孔。96孔板置于5%CO2，37 ℃孵育48 h，分別加入200 μl含有0.5 μg/ml，1.0 μg/ml，2.0 μg/ml，4.0 μg/ml，8.0 μg/ml EOP和CDDP繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后用每孔加入180 μl無血清培養(yǎng)基和20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后棄掉上清培養(yǎng)液，每孔中加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。選擇EOP和CDDP刺激LLC細胞和KMB-17細胞的的最佳作用濃度。

1.2.3 細胞劃痕法觀察EOP及CDDP對LLC細胞遷移的影響 ①先用Maker筆在六孔板背后，用直尺比著，均勻的劃出橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。②在孔中加入5×105個細胞。③次日用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。④用PBS洗細胞3次，洗掉劃下的細胞，加入新鮮的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑤置于37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h拍照，觀察細胞遷移情況。

1.2.4 Realtime PCR法檢測caspase3 mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA，Nanodrop 2000微量核酸分析儀檢測RNA的純度及濃度。用5 μg RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)測定的RNA濃度，計算5 μg反轉(zhuǎn)錄所需RNA的量，加入0.2 mLEP管中；加入Oligo dT(18)1 μL；補加無RNA酶水至11 μL，輕彈管壁混勻，瞬離；PCR儀上65 ℃變性5 min后迅速置于冰上，使之冷卻，防止二級結(jié)構的產(chǎn)生；然后加8 μL 的MIX，體系如下：Transcript Reversase 1 μL，Transcript Reversase Inhibitor 1 μL，5×reaction Buffer 4 μL，10 mM dNTP 2 μL，總體積為20 μL，輕彈管壁混勻，瞬時離心將液體甩至管底，設置PCR儀孵育42 ℃反應60 min，70 ℃ 5 min終止反應，-20 ℃保存待用。Real time PCR加樣體系如下：2×SYBR Green 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 5 μg，補無菌雙蒸水至20 μL。加完樣后上熒光定量PCR儀反應。反應程序如下：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)40個循環(huán)，72 ℃10 min。

1.2.5 Western blotting法檢測caspase3蛋白表達 按照100 μL 細胞裂解液RIPA加1 μL蛋白酶抑制劑PMSF來提取腦腫瘤細胞總蛋白，采用BCA法檢測胞總蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，100 V恒壓電泳2 h，待目的條帶分離開后300 mhA橫流轉(zhuǎn)膜1 h，將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體PVDF膜上。PVDF膜在TBST中洗5 min以洗掉膜上的transbuffer，然后在含5%脫脂奶粉的TBST中以800 rpm/min，室溫封閉2 h，孵育一抗，小鼠抗人caspase3抗體稀釋比例為1∶1 000，鼠抗β-actin抗體稀釋比例為1∶1 000，稀釋液為5%BSA，放入濕盒中在4 ℃冰箱孵育過夜。次日，TBST洗膜4次，每次15 min。山羊抗小鼠IgG二抗1∶5 000，室溫孵育2 h，用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行ECL化學發(fā)光顯色。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測定EOP及CDDP抑制LLC、KMB-17細胞生長的最佳作用濃度

分別將含有0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、4.0 μg/ml、8.0 μg/ml EOP和CDDP培養(yǎng)基200 μL加入單層LLC和CDDP細胞培養(yǎng)，MTT法檢測EOP及CDDP抑制LLC、KMB-17細胞生長的最佳作用濃度，結(jié)果顯示：實驗組中，與對照組相比，2.0 μg/ml，4.0 μg/ml，和8.0 μg/ml EOP均可不同程度的抑制LLC細胞核KMB-17細胞的生長，其中4.0 μg/ml的EOP可明顯抑制LLC和KMB-17細胞的增殖，具有顯著性差異(P<0.01)。同樣，陽性對照組也有相同的結(jié)果，與對照組相比，2.0 μg/ml，4.0 μg/ml，和8.0 μg/ml CDDP均可不同程度的抑制LLC細胞核KMB-17細胞的生長，其中4.0 μg/ml的CDDP可明顯抑制LLC和KMB-17細胞的增殖，具有顯著性差異(P<0.01)。因此4.0 μg/ml 作為后續(xù)實驗EOP和GDPP的最佳刺激時間，具體結(jié)果見圖1。

2.2 細胞劃痕法觀察EOP及CDDP對LLC細胞遷移的影響

4 μg/ml EOP和4 μg/ml CDDP分別作用于小鼠Lewis肺腺癌LLC細胞株48 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，4 μg/ml EOP和4 μg/ml CDDP均可顯著抑制LLC細胞的增殖遷移，劃痕部分覆蓋率下降，腫瘤細胞侵襲程度明顯降低，說明EOP可抑制肺腺癌LLC腫瘤細胞的遷移，具有顯著的抑癌效果。見圖2。

2.3 Western blot法檢測caspase-3蛋白水平的表達

采用RIPA法提取正常對照組、EOP作用組和CDDP作用組的LCC細胞總蛋白，BCA定量法進行DNA定量，取30 μg蛋白變性后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測3種細胞中caspase3蛋白水平的表達。結(jié)果顯示：EOP組和CDDP組caspase3的mRNA與對照組相比，顯著增加，P<0.01，具體結(jié)果見圖3。

2.4 RT-PCR法檢測caspase-3mRNA水平的表達

TRIZOL法提取正常對照組和EOP作用組，CDDP作用組的LLC細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量RCR檢測3種細胞中caspase3 mRNA水平的表達。結(jié)果顯示：EOP組和CDDP組caspase3 mRNA的表達水平與對照組比較，顯著增高，P<0.01，具體結(jié)果見圖4。

圖1 MTT法檢測不同濃度EOP和CDDP對LLC和KMB-17細胞的抑制作用

圖2 細胞劃痕法

圖3 Western blot法檢測caspase-3蛋白表達水平

圖4 RT-PCR法

3 討論

肺癌是近年來嚴重威脅人類生命和健康的惡性腫瘤，它的發(fā)病率居重癥疾病首位，也是死亡率極高的惡性腫瘤。近50年來肺癌的發(fā)病率和死亡率明顯增高，發(fā)達國家更為明顯，我國肺癌發(fā)病也呈增長趨勢，近20年來每年肺癌新發(fā)病例以大約0.5%的速度增長，死亡率增加了近1.5倍，是增長最快的惡性腫瘤。

惡性腫瘤在化療上的風險在于一旦治療方案失敗，將產(chǎn)生多藥耐藥，患者生存期將減少，生活質(zhì)量下降。然而杜仲在抗腫瘤作用的具體作用機制目前尚不清楚。現(xiàn)有的研究僅表明，EOP具有清除氧自由基，提高機體的抗氧化能力，減輕細胞損傷，減少過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的產(chǎn)生、增強超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的作用。其具體機制尚有待深入研究[8-9]。

細胞凋亡過程的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。凋亡的調(diào)控基因很重要的家族是Caspase3超家族[10]。Caspase3在許多惡性腫瘤中高表達，抑制腫瘤細胞凋亡，研究Caspase3的表達情況對腫瘤的治療和預后有重要意義[11-12]。

本研究中發(fā)現(xiàn)：EOP和CDDP抑制LLC細胞和KMB-17細胞增殖的最佳作用濃度為4.0 μg/ml，最佳作用時間為48 h。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，EOP和CDDP均可顯著抑制腫瘤細胞LLC的侵襲遷移，劃痕細胞覆蓋率降低。RT-PCR和western blot 結(jié)果顯示，EOP組的caspase3的mRNA水平和蛋白水平的表達均顯著高于對照組。與王強等[6]的發(fā)現(xiàn)一致，caspase3在肺癌組織中表達升高，杜仲總多糖EOP可抑制肺癌細胞LLC的增殖，并且是通過誘導caspase3途徑活化，促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤的繼續(xù)擴增，為杜仲總多糖在臨床的應用提供了扎實的理論研究基礎。