董曉鋒， 王全楚， 鄭嬌嬌， 朱曉紅， 張 燕， 劉妲妲， 梁 棟， 王建斌

1.解放軍第153中心醫(yī)院感染科，河南 鄭州 450042; 2.河南大學(xué)腫瘤標(biāo)志物與液體活檢實(shí)驗(yàn)室

線粒體是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)能量代謝和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞器，線粒體功能正常對(duì)我們非常重要，而線粒體DNA含量的異常也會(huì)影響其功能的正常發(fā)揮[1]?，F(xiàn)在越來越多的研究[2-5]表明，腫瘤與mtDNA的突變有關(guān)，也有研究表明，mtDNA含量變化與結(jié)腸癌[6]、卵巢癌[7]、胃癌[8]、肺癌[9]等均有相關(guān)性。

現(xiàn)已有研究[10]表明，在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者中，腫瘤組織的mtDNA含量顯著低于非腫瘤組織；外周血白細(xì)胞中mtDNA含量顯著低于非癌患者[11]。此外，WANG等[12]研究了血清中游離mtDNA含量變化與患肝硬化風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，表明游離mtDNA含量降低，患肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)增高。本研究旨在探討血清中游離mtDNA含量與HBV患者患HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2015年10月至2016年10月解放軍第153中心醫(yī)院就診的HCC初診患者和HBV感染患者，其中156例HBV感染相關(guān)的HCC患者作為本研究的試驗(yàn)組，男128例，女28例，年齡(54.0±9.7)歲。收集同期非HCC的HBV感染患者312例作為對(duì)照組，男246例，女66例，年齡(54.2±9.4)歲。HCC患者診斷嚴(yán)格依照2001年中國抗癌協(xié)會(huì)專業(yè)委員會(huì)修訂的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]，HBV患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。本研究獲得相關(guān)機(jī)構(gòu)委員會(huì)的批準(zhǔn)并獲得受試對(duì)象的知情同意。

1.2研究方法

1.2.1 基本信息：通過病例審查和咨詢主治醫(yī)師收集所有參與者的基本信息和臨床資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量、種族、居住區(qū)域、吸煙史、飲酒史、是否肝硬化、家族HCC病史、家族HBV病史、家族肝硬化病史等。其中，個(gè)人吸煙≥100支認(rèn)為有吸煙史，<100支認(rèn)為無吸煙史[15]。

1.2.2 標(biāo)本采集：收集每例患者的血液樣本，分離血清，并于-80 ℃保存，所有血清樣本的DNA均采用QIAamp Blood Mini Kit進(jìn)行提取。每例患者HCC和HBV的診斷指標(biāo)均通過相關(guān)臨床化驗(yàn)及影像學(xué)檢查而得。

1.2.3 主要試劑和儀器：QIAamp Blood Mini Kit(Qiagen公司，德國)；Eppendorf 542離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；恒溫混勻儀ThermoMixerc(德國Eppendorf公司)；LX-200迷你離心機(jī)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Vortex-6渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司，美國)；ViiA7 qRT-PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)，引物由上海生工合成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。χ2檢驗(yàn)比較兩組之間的分類變量，t檢驗(yàn)比較其連續(xù)變量，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較兩組參與者血清中mtDNA含量的差異性。采用中位數(shù)和四分位間距分別對(duì)mtDNA含量進(jìn)行分類，對(duì)血清中mtDNA含量與患HBV相關(guān)的HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行單因素和多因素的邏輯回歸模型分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同特征患者血清mtDNA含量?jī)山M患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、是否肝硬化、HBV家族史、肝硬化家族史及癌癥家族史比較，血清mtDNA含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)組和對(duì)照組患者血清mtDNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.905)，但試驗(yàn)組患者血清mtDNA含量有低于對(duì)照組患者血清mtDNA含量的趨勢(shì)。在試驗(yàn)組中，年長(zhǎng)者和年輕者患者血清mtDNA含量差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.064)，但年長(zhǎng)者較年輕者血清mtDNA含量也有降低的趨勢(shì)。在對(duì)照組中，年長(zhǎng)者mtDNA 含量顯著低于年輕者(P=0.028)(見表1)。

表1 不同特征患者血清mtDNA含量的分布情況Tab 1 Distribution of serum mtDNA content in patients with different characteristics

續(xù)表1

變量 mtDNA中位數(shù)(四分位距)對(duì)照組試驗(yàn)組P1值 P2值0.3250.701 HBV家族史 無1.421(0.353～3.926)0.968(0.300～4.127)0.887 有1.882(0.469～4.188)1.361(0.305～2.902)0.971 P2值0.7010.888 肝硬化家族史 無1.616(0.370～4.116)1.228(0.319～3.847)0.632 有1.616(0.301～3.513)1.091(0.292～2.768)0.380 P2值0.5250.351 癌癥家族史 無1.419(0.327～3.536)1.006(0.271～3.946)0.226 有2.063(0.635～5.210)1.325(0.414～2.930)0.098 P2值0.0540.305

注：P1值為試驗(yàn)組與對(duì)照組的比較，P2值為兩組內(nèi)部根據(jù)患者特征的分層比較。

2.2mtDNA含量與HBV-HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性在年輕患者中，單因素分析結(jié)果表明，低含量mtDNA與HCC的發(fā)病無顯著的相關(guān)性，但低含量mtDNA患者的患癌率相比于高含量mtDNA患者有增加的趨勢(shì)(OR=1.731，95%CI：0.999～2.99 9，P=0.050)。多因素分析結(jié)果表明，低含量mtDNA是患者患HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，mtDNA含量低的患者患HCC的危險(xiǎn)度是mtDNA含量高患者的2.209倍(P=0.012)。表明在較年輕的患者中，低含量的mtDNA與發(fā)生HCC具有顯著的相關(guān)性，而在較年長(zhǎng)的患者中，mtDNA含量的高低與患HCC無顯著的相關(guān)性(見表2)。

在無肝硬化患者中，單因素分析結(jié)果表明低含量mtDNA與患者患HCC有顯著的相關(guān)(OR=2.177，95%CI：1.086 ～4.363，P=0.028)；多因素分析結(jié)果也表明低含量mtDNA是患者患HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，mtDNA含量低的患者患HCC的危險(xiǎn)度是mtDNA含量高患者的2.049倍(P=0.049)。在肝硬化患者中，mtDNA含量與患者患HCC無顯著的相關(guān)性(P>0.05)(見表3)。

根據(jù)患者有無HBV家族史、有無肝硬化家族史、有無癌癥家族史分別分析mtDNA含量與患HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，其結(jié)果顯示，mtDNA含量與HBV-HCC風(fēng)險(xiǎn)在HBV家族史、肝硬化家族史、癌癥家族史等方面無明顯相關(guān)性(P>0.05)(見表4)。

表2 mtDNA含量與HBV-HCC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性在不同年齡的分層分析Tab 2 A stratified analysis of correlation between mtDNA content and HBV-HCC risk at different ages

注：mtDNA含量以對(duì)照組中mtDNA含量的中位數(shù)為分界點(diǎn)，即≤1.616為低值，>1.616為高值；多因素分析的調(diào)整因素有肝硬化、吸煙史、飲酒史、HBV家族史、癌癥家族史、肝硬化家族史、性別。

3 討論

線粒體在細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮著重要作用，由于人線粒體在三磷酸腺苷生成過程中產(chǎn)生活性氧，因此，線粒體DNA容易受到氧化損傷，組織和血清中mtDNA拷貝數(shù)的改變和損耗與不同氧化應(yīng)激條件下的多種疾病相關(guān)[16]。在過去的幾年里，人們對(duì)線粒體DNA能否用于評(píng)估癌癥風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了廣泛的研究，這些研究最初絕大多數(shù)集中在腫瘤組織的mtDNA含量，隨后為外周血淋巴細(xì)胞中的mtDNA含量[17]。多數(shù)研究[18-20]認(rèn)為，mtDNA含量降低會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，然而也有研究[16-21]認(rèn)為，mtDNA含量升高會(huì)增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。除了這些矛盾的結(jié)果外，這些樣本也有一定的局限性，以腫瘤組織為樣本，雖然可以很好地反映腫瘤組織的特征，但也在一定程度上忽略了患者的遺傳背景；外周血淋巴細(xì)胞可以很好地反映個(gè)體的遺傳背景，在流行病學(xué)中也得到了廣泛的應(yīng)用，但其作為非侵入性腫瘤標(biāo)志物也存在一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)以外周血為樣本，分析血清中游離mtDNA含量與HBV-HCC的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性。血液中的游離mtDNA來自多種方式，包含來自壞死細(xì)胞DNA、凋亡細(xì)胞DNA、血液細(xì)胞DNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA等，因此，在一定程度上更能體現(xiàn)疾病的狀態(tài)變化[22]。

表3 mtDNA含量與HBV-HCC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性在肝硬化方面的分層分析Tab 3 Stratified analysis of correlation between mtDNA content and HBV-HCC risk in patients with liver cirrhosis

注：mtDNA含量以對(duì)照組中mtDNA含量的中位數(shù)為分界點(diǎn)，≤1.616為低值，>1.616為高值；多因素分析的調(diào)整因素肝硬化、有吸煙史、飲酒史、HBV家族史、癌癥家族史、肝硬化家族史、性別。

表4 mtDNA含量與HBV-HCC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性在疾病家族史方面的分層分析Tab 4 Stratified analysis of correlation between mtDNA content and HBV-HCC risk in family history of disease

注：mtDNA含量以對(duì)照組中mtDNA含量的中位數(shù)為分界點(diǎn)，≤1.616為低值，>1.616為高值；多因素分析的調(diào)整因素有肝硬化、吸煙史、飲酒史、HBV家族史、癌癥家族史、肝硬化家族史、性別。

本研究結(jié)果顯示，在無肝硬化的HBV患者中，mtDNA含量低的患者比mtDNA含量高的患者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，而該結(jié)果在肝硬化患者中并不顯著，原因很可能是肝硬化本身就是發(fā)生HCC的危險(xiǎn)因素，因此掩蓋了游離mtDNA含量與HBV患者患HCC風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性，WANG等[12]研究中就顯示肝硬化患者的游離mtDNA含量顯著低于非肝硬化患者，因此在肝硬化的HCC患者和非HCC患者中其游離mtDNA含量的差異并不顯著。

研究結(jié)果同時(shí)也顯示，年長(zhǎng)患者mtDNA含量比年輕患者的mtDNA含量低，其在對(duì)照組中表現(xiàn)較為顯著，由此可知，mtDNA含量與年齡也有很大關(guān)系，這也與DIMMOCK等[23]的報(bào)道一致，即外周血中mtDNA含量會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少。游離mtDNA含量與HBV-HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性在年輕患者中表現(xiàn)的較為顯著，而在年長(zhǎng)者中表現(xiàn)不顯著，可能是由于隨著年齡的增長(zhǎng)基因改變所產(chǎn)生的影響掩蓋了游離mtDNA含量改變所產(chǎn)生的影響。

mtDNA含量正常對(duì)維持細(xì)胞的正常呼吸有重要作用。有研究[24]表明，對(duì)老鼠肝細(xì)胞線粒體功能障礙進(jìn)行保護(hù)可以減慢肝纖維化。HCC、肝硬化患者mtDNA含量降低的原因可能為：(1)mtDNA的D-loop區(qū)發(fā)生點(diǎn)突變，影響其正常復(fù)制[25]，有研究[26]報(bào)道，mtDNA的D-loop區(qū)異常在HBV-HCC患者中廣泛存在；(2)線粒體的生物學(xué)改變減少了相關(guān)蛋白的表達(dá)，如單鏈DNA結(jié)合蛋白、線粒體轉(zhuǎn)錄因子[27-28]。詳細(xì)了解mtDNA含量改變與肝硬化、HCC發(fā)病機(jī)理之間的關(guān)系，將有助于我們進(jìn)一步了解線粒體在HCC、肝硬化發(fā)展中的作用。

總之，通過病例對(duì)照研究對(duì)血清中游離mtDNA含量與HBV患者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示，血清中游離mtDNA含量降低可能與HBV相關(guān)HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性，這一現(xiàn)象在年輕HBV患者和非肝硬化HBV患者中表現(xiàn)顯著。在較為年輕的HBV感染人群和無肝硬化的HBV感染人群中，血清中游離mtDNA含量降低與HBV相關(guān)的HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有顯著相關(guān)性，游離mtDNA有望作為這類特定人群的HBV-HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物。但研究結(jié)果的臨床意義需要采用進(jìn)一步的大樣本量的前瞻性研究和分子病理機(jī)制研究進(jìn)行驗(yàn)證。