簡永遠 許展毓 馮 旭 鄭寶石 覃家錦 謝曉勇

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021)

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD，簡稱先心病)為胚胎發(fā)育異常所引起的心臟和血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能的先天畸形，嚴重危害嬰幼兒健康，其病因主要為環(huán)境因素和遺傳因素[1]。心臟發(fā)育涉及各種轉(zhuǎn)錄因子在不同時間和空間上的調(diào)控以及多種基因的精確表達。相關(guān)基因發(fā)生改變是導(dǎo)致CHD的常見原因[2]。NKX 2.5基因是所有脊椎動物心臟發(fā)生中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子，其改變可引起基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄活性的變化，影響心臟發(fā)育。據(jù)文獻報道，房間隔缺損(atrial septal defect，ASD)的發(fā)病率己經(jīng)超過室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)和動脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus，PDA)，成為CHD最常見的類型[3]，然而大部分ASD的遺傳學(xué)機制尚不明確。因此，我們擬采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)以及DNA測序技術(shù)，探討廣西壯族人群ASD與NKX 2.5基因突變的關(guān)系，從基因?qū)用嫣剿鰽SD患者的遺傳學(xué)背景，以尋找ASD新的易感基因和突變位點?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月1日至2018年3月1日廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所收治的30例ASD患者，年齡3個月至50歲，平均18.6歲，其中男13例，女17例。所有患者均無心臟病家族史,并經(jīng)超聲心動圖、心導(dǎo)管造影、心電圖、胸片診斷及心臟手術(shù)確診。排除染色體疾病者(如21-三體綜合征)、綜合性先天性心臟病(如charge綜合征、DiGeorge綜合征)者。選取同期入本院小兒外科、創(chuàng)傷手外科、骨關(guān)節(jié)外科患者30例，排除其他心臟相關(guān)疾病或重大疾病者。所有入選對象祖籍均為廣西，其父母民族均為廣西壯族，且相互無親屬關(guān)系。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準，且患者或家屬均知情同意并簽字。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 標本采集 患者入院時均采集空腹外周靜脈血3～5 mL至真空EDTA抗凝采血管，混勻，將達標的樣品置于-80℃冰箱存放，待測。

1.3 制備基因組DNA 借助抽提試劑盒(Wizard Genomic DNA Extraction Kit，Promega)，遵照相關(guān)操作步驟以及標準從外周靜脈血基因中獲取對應(yīng)的基因組脫氧核糖核酸(genomic DNA，gDNA)。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中NKX2-5基因的gDNA序列，利用Primer 3.0軟件在線設(shè)計6對引物,擴增片段長度350～600 bp，退火溫度55℃～57℃，擴增片段為NKX 2-5基因所有外顯子及外顯子內(nèi)含子交接處。見表1。

表1 NKX 2.5基因外顯子的引物信息

1.5 NKX2.5基因目標區(qū)域的擴展 以gDNA為模板，分別使用上述4對引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目的基因片段。PCR反應(yīng)體系：50 μL中，gDNA約0.25 g，10×反應(yīng)緩沖液2.5 L，脫氧核糖核苷酸dNTP 2 μL，上、下游引物各 1 μL，DNA聚合酶(DNA polymerase)1.25 U。其中，PCR的發(fā)生條件如下：預(yù)變性環(huán)節(jié)，溫度95℃，時間5 min；變性環(huán)節(jié)，溫度95℃，時間30 s；退火環(huán)節(jié)，溫度范圍60℃～61℃，時間60 s；延伸環(huán)節(jié)，溫度72℃，時間45 s；終延伸環(huán)節(jié)，溫度72℃，時間7 min。35個循環(huán)后，將獲得的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳處理，再行EB染色，最后用紫外光鑒定產(chǎn)物。

1.6 DNA測序 所有PCR擴增產(chǎn)物均采用DNA膠回收試劑盒進行純化。測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，以PCR下游引物為測序引物，使用ABI Prism 3130XL型自動熒光測序電泳測序。使用序列分析軟件分析測序結(jié)果并將所測序列與GenBank中的已知序列進行比對以識別基因變異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，等位基因及各基因型的頻率分布比較用χ2檢驗,行雙側(cè)檢驗，檢驗水準取α=0 .05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR結(jié)果 PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖電泳處理之后，將其與DNA marker對比，各片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物長度與所設(shè)計的各片段大小預(yù)期值符合,特異性較理想。

2.2 DNA測序結(jié)果 在CHD患者的NKX 2-5基因識別出1個不改變氨基酸的單核苷酸多態(tài)(single-nucleotide polymorphisms,SNPs) ，位于NKX 2.5基因第二外顯子編碼序列第606位的鳥嘌呤(G)為胞嘧啶(C)，即c. 606G>C-多態(tài)(rs3729753，Leu202Leu)，其等位基因G、C及其構(gòu)成的3種基因型(GG、GC、CC)。兩組基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.131，P=0.568)；兩組等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.269，P=0.260)。其中，對應(yīng)的等位基因G、C 以及其組合基因GG、GC、CC等的分布情況見表2。各基因型在總體研究人群中的頻率分布經(jīng)χ2校驗后符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.516，P=0.773)。

表2 NKX 2.5基因606位點的基因型和等位基因頻率分布 [n(%)]

3 討 論

人類NKX 2.5基因定位于染色體5q3511，作為轉(zhuǎn)錄因子具有2個外顯子和1個內(nèi)含子，該基因5′端側(cè)翼序列與第一外顯子之間包含有重要功能的基因調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，從而使其能夠在心臟的發(fā)育、形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。NKX 2.5基因可編碼含有324個氨基酸的蛋白，對心臟的發(fā)生發(fā)育起著極為重要的作用。NKX 2.5作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起始端，參與了心臟前體細胞的分化、心臟環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成及成體心臟正常功能的維持，并持續(xù)表達于心肌細胞分化的各個階段，在胚胎、胎兒直到成體心肌細胞中均保持一定的表達水平[5]。

迄今為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40余種NKX 2.5基因突變可導(dǎo)致先天性心臟病。這些突變大多是外顯子的無義突變、錯義突變、剪接信號突變，以及寡核苷酸序列插入或缺失導(dǎo)致內(nèi)含子剪接異常、閱讀框架異位引起蛋白質(zhì)截斷等。與此同時，70余種與人類CHD相關(guān)的NKX 2.5基因單核苷酸多態(tài)性位點也被陸續(xù)報道[6]。研究發(fā)現(xiàn)CHD表型可能與突變位點及頻率有關(guān)，但表型與基因型之間關(guān)系仍需確定。NKX 2.5基因突變大多是在國外研究中發(fā)現(xiàn)的，我國先心病人群NKX 2.5基因突變較為少見。Huang等[7]研究我國山東地區(qū)340例VSD患者，在NKX 2.5基因的上游增強子和外顯子中發(fā)現(xiàn)了兩個新的雜合子DNA序列變異，顯著降低了基因轉(zhuǎn)錄活性。其他關(guān)于散發(fā)CHD人群的突變研究，比如張為民等[8]篩查了120例維吾爾族ASD患者，并未檢測出NKX 2.5基因突變。本課題對我國壯族地區(qū)30例散發(fā)型單純性CHD患者的研究中均未檢測到致病突變，提示NKX 2.5基因突變的發(fā)生可能限于某些家系或一些帶有特殊表型的個體中，其與散發(fā)型單純性CHD的相關(guān)性可能存在地域和種族差異。

本研究通過對30名廣西壯族ASD患者及30例廣西壯族對照病例進行NKX 2.5基因的突變篩查，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變。僅在NKX 2.5基因編碼序列第606位檢測到鳥嘌呤變?yōu)榘奏ぃ碿. 606G>C SNPs。本實驗SNPs為不改變氨基酸的單核苷酸多態(tài)，屬于同義突變。研究發(fā)現(xiàn)[9]，同義密碼子影響著生物體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄、信使 RNA的翻譯，以及合成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性；還會改變mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，影響mRNA的降解速率。

對于未能發(fā)現(xiàn)廣西壯族地區(qū)CHD新的基因突變位點，我們認為，因本實驗樣本量較少，尚有待進行更廣泛的篩查。另外，推測NKX 2.5基因突變可能是通過與其他基因相互作用導(dǎo)致CHD的發(fā)生。僅針對NKX 2.5基因測序和突變篩查，仍然不能完全解釋NKX 2.5基因突變導(dǎo)致CHD的發(fā)病機制，下一步對于突變的轉(zhuǎn)錄活性、蛋白質(zhì)功能等尚有待進一步研究。