孫 靜， 于龍政， 薛書江， 李海峰， 許應(yīng)天

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

東方泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的東方泰勒蟲(Theileriaorientalisi) 舊稱瑟氏泰勒蟲(Theileriasergenti)寄生于牛紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)所引起的一種蜱傳性原蟲病，臨床上以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫大為主要特征。本病有明顯的季節(jié)性，新引進(jìn)牛和改良牛的發(fā)病率、病死率均高。近年來，東方泰勒蟲病在我國東北、西北、華北、華南等地區(qū)流行嚴(yán)重，給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，東方泰勒蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷有乳膠凝集試驗(yàn) (LA)、間接熒光抗體試驗(yàn) (IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[1-6]，而至今尚未見有關(guān)東方泰勒蟲PCR-ELISA的報(bào)道。本研究旨在根據(jù)東方泰勒蟲主要表面蛋白(MPSP)基因的可變區(qū)設(shè)計(jì)合成引物，建立適合于東方泰勒蟲病的流行病學(xué)調(diào)查和口岸檢疫的PCR-ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 材料 東方泰勒蟲基因標(biāo)準(zhǔn)品為瑟氏泰勒蟲p33基因重組質(zhì)粒，由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制保存。陰性對(duì)照樣本為經(jīng)常規(guī)PCR檢測為東方泰勒蟲感染陰性的健康牛血液基因組DNA。被檢樣本112份為牛抗凝血中提取的基因組DNA，血液樣本為采自吉林省琿春市某養(yǎng)牛場。

2) 主要試劑 血液DNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA生物公司)；Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)；鏈霉親和素(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；TMB顯色液、鮭魚精DNA(Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗地高辛抗體(鼎國公司產(chǎn)品)。

3) 合成引物 根據(jù)GenBank中公布的東方泰勒蟲p33蛋白基因序列(DQ078264)，用Primer Permie 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并其上下游引物的5’端分別標(biāo)記上生物素(BIOT)和地高辛(DIG)，該引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

P1上游：5’- BIOT-AGG GAT ACC GCA TCA AGA CAC-3’

P2下游：5’-DIG- TCA TCG GAA CCG ACG TAA ACT-3’。

1.2 PCR-ELISA檢測方法的建立

1) PCR擴(kuò)增及最佳退火溫度的篩選 PCR擴(kuò)增以東方泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在50 μL體系中進(jìn)行：10× Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，模板DNA 4 μL，引物1、2各2 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水補(bǔ)齊至50 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，以條帶亮度判斷最佳退火溫度。

2) ELISA檢測 將鏈酶親和素用0.05 mol/L，pH值9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜，用PBST洗板5次；用含40 mg/L脫脂乳的PBS稀釋鮭魚精DNA，200 μL/孔封閉酶標(biāo)板，37 ℃孵育2 h，同上法洗板3次；用PBS稀釋PCR產(chǎn)物，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次；用PBS稀釋HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次；每孔加入100 μL臨時(shí)配置的TMB-H2O2顯色液，室溫避光顯色； 最后加入50 μL 2M H2SO4終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上測定OD450nm值。

3) ELISA最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化 在相同反應(yīng)條件下，對(duì)鏈酶親和素包被濃度(10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL)和HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體稀釋度(1∶1 000～1∶5 000)做方陣滴定。對(duì)封閉液魚精DNA濃度(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL)和封閉時(shí)間(5、90、120 min)進(jìn)行篩選優(yōu)化。分別在顯色液10、25、20和25 min后終止反應(yīng)，測定OD450nm值。

5) 敏感性試驗(yàn) 以超微量分光光度計(jì)測定收集的東方泰勒蟲套式PCR陽性產(chǎn)物DNA含量，用去離子水稀釋成10倍濃度梯度，以得到的不同濃度DNA為模板，按所建立的PCR-ELISA進(jìn)行檢測，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR做比較，評(píng)價(jià)其敏感性。

6) 特異性試驗(yàn) 對(duì)弓形蟲、環(huán)形泰勒蟲、新孢子蟲及健康牛血的基因組DNA，按所建立的PCR-ELISA進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)其特異性。

7) 重復(fù)性評(píng)價(jià) 在同一批次包被的酶標(biāo)板上對(duì)4份東方泰勒蟲套式PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每份重復(fù)5次，評(píng)價(jià)其批內(nèi)重復(fù)性。在5個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板上對(duì)4份東方泰勒蟲套式PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，測定OD450nm值，計(jì)算變異系數(shù)。

8) 被檢樣本的檢測 用所建立的PCR-ELISA對(duì)采自琿春市某牧場的112份被檢血液樣本基因組DNA進(jìn)行檢測，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，比較兩者的陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR最佳退火溫度的篩選

以上述PCR反應(yīng)體系，分別在50，51，52，54，56，58，59，60 ℃的退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在56 ℃時(shí)目的條帶最亮，因此,確定56 ℃為最佳退火溫度(圖1)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：50 ℃；2：51 ℃；3：52 ℃；4：54 ℃；5：56 ℃；6：58 ℃；7：59 ℃；8：60 ℃

圖1溫度梯度PCR結(jié)果

Fig.1PCRresultsattemperaturegradient

2.2 ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

經(jīng)試驗(yàn)確定鏈酶親和素包被濃度為5 μg/mL，HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體稀釋度為1∶2 000(表1)，魚精DNA濃度1 mg/mL，封閉1 h(表2)，顯色15 min為最佳反應(yīng)條件(表3)。

表1 鏈酶親和素及HRP標(biāo)記抗地高辛抗體方陣檢測的P/N值

表2 封閉液各工作濃度及時(shí)間檢測的P/N值

表3 顯色時(shí)間的確定

2.3 PCR-ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

2.4 敏感性試驗(yàn)

以PCR-ELISA對(duì)濃度分別為18、1.8、0.18 ng/μL和18、1.8、0.18 pg/μL的東方泰勒蟲基因組DNA檢測。結(jié)果顯示，常規(guī)PCR能檢測的最低模板濃度為0.18 ng/μL(圖2)，而所建立的PCR-ELISA能檢測的最低模板濃度為18 pg/μL，證明PCR-ELISA的敏感性比常規(guī)PCR高10。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6：DNA 濃度分別為18、1.8、0.18 ng/μL和18、1.8、0.18 pg/μL.

圖2PCR-ELISA及常規(guī)PCR敏感性的檢測結(jié)果

Fig.2ThesensitivitydetectionofthepurifiednucleicacidsextractedfromT.orientalisibyPCR-ELISAandPCR

2.5 特異性試驗(yàn)

用所建立的PCR-ELISA對(duì)牛弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛新孢子蟲及健康的牛血液基因DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果除東方泰勒蟲外，其他OD450nm值均小于判定標(biāo)準(zhǔn)，無交叉反應(yīng)，OD450nm值分別為0.132、0.103、0.119和0.104。結(jié)果表明，所建立的PCR-ELISA方法特異性好，無交叉反應(yīng)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照所建立的方法，求得批內(nèi)變異系數(shù)為6.23%～7.84%，批間變異系數(shù)為5.11%～7.19%，均低于10%，證明本方法具有較好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣本檢測

用所建立的PCR-ELISA法及常規(guī)PCR法，對(duì)112份待檢樣本進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，常規(guī)PCR陽性檢出率為28.6%(32/112)，PCR-ELISA陽性檢出率為34.8%(39/112)，其中常規(guī)PCR檢測為陰性的7份樣本經(jīng)PCR-ELISA檢測均為陽性，陽性符合率為82.1%(表4)。

表4 PCR-ELISA法與常規(guī)PCR法的比較

3 討論與結(jié)論

東方泰勒蟲的常規(guī)檢測以血涂片鏡檢和常規(guī)PCR為主，但眾所周知，血涂片鏡檢敏感性較低，常規(guī)PCR雖因其簡便快速，被廣泛應(yīng)用于各病原體的檢測，但該方法需要使用溴化乙錠染色，存在一定的安全隱患，結(jié)果以對(duì)條帶的直觀觀察為準(zhǔn)，影響敏感度，兩者均不適合于批量樣本的檢測。因此，本研究建立了適合于批量樣本檢測的東方泰勒蟲PCR-ELISA。

東方泰勒蟲P33蛋白是紅細(xì)胞感染階段表達(dá)在蟲體表面的一種膜內(nèi)蛋白，該蛋白基因的開放閱讀框長度為849 bp，編碼以亮氨酸leu、賴氨酸lys為主的283個(gè)氨基酸，親水性較好，該蛋白抗原決定簇豐富，被認(rèn)為是診斷和預(yù)防東方泰勒蟲病的最佳候選抗原[7-8]。因此，本研究以東方泰勒蟲p33基因作為靶基因建立了T. sergenti的PCR-ELISA。

傳統(tǒng)的PCR-ELISA 是一種集雜交探針特異性、PCR定性分析、ELISA定量檢測及酶標(biāo)儀結(jié)果客觀性等優(yōu)點(diǎn)的檢測技術(shù)[9-10]，有效地避免了常規(guī)PCR的假陽性和假陰性結(jié)果[11]，并且操作中不需要特殊儀器試劑，避免接觸放射性物質(zhì)，已被廣泛運(yùn)用于各個(gè)領(lǐng)域[12-13]。本試驗(yàn)在傳統(tǒng)的PCR-ELISA基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良和優(yōu)化，即在PCR的上、下游引物上分別標(biāo)記生物素和地高辛，使PCR產(chǎn)物兩端直接帶標(biāo)記物，省去探針雜交過程，簡化了操作。由于本研究采用了鏈霉親和素—生物素和地高辛—抗地高辛抗體系統(tǒng)，其敏感性高于單純的 PCR和ELISA檢測，能檢出18 pg/μL的T.orientalisi基因組DNA，是常規(guī)PCR的10倍，且不與環(huán)形泰勒蟲、弓形蟲和新孢子蟲發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于10%，說明所建立的東方泰勒蟲PCR-ELISA具有較好的敏感性和特異性，而且重復(fù)性良好，該結(jié)果與夏曉輝等[5]報(bào)道的基本一致。

由于PCR-ELISA的操作在開發(fā)環(huán)境中進(jìn)行，且根據(jù)各孔的OD450nm值判斷結(jié)果，所以規(guī)范化操作是試驗(yàn)準(zhǔn)確性的保證。所以PCR過程和ELISA操作需在2個(gè)獨(dú)立環(huán)境下進(jìn)行，避免相互污染，造成假陽性。如果PCR產(chǎn)物的稀釋在孔中進(jìn)行，由于分子量較大的PCR產(chǎn)物擴(kuò)散緩慢，就會(huì)影響其與孔底鏈霉親和素的結(jié)合，所以PCR產(chǎn)物的稀釋應(yīng)在外界進(jìn)行。

用所建立的PCR-ELISA對(duì)112份待檢樣本進(jìn)行T.orientalisi檢測的結(jié)果表明，陽性檢出率為34.8%，高于常規(guī)PCR的結(jié)果(28.6%)，其中，常規(guī)PCR檢測為陰性的7份樣本經(jīng)PCR-ELISA檢測為陽性，有效地防止了對(duì)隱性感染病例的漏診。綜上所述，本研究建立的東方泰勒蟲PCR-ELISA具有敏感、特異、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)，適用于東方泰勒蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查和口岸檢疫等批量T.orientalisi的檢測。