田 文, 金美玉, 于 垚, 李金蓉, 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 延吉 133002)

金線蓮是一種十分珍稀的中草藥，可全草入藥，其味甘，性微寒，具有清熱解毒的功效[1]。金線蓮目前在臨床上的應(yīng)用比較廣泛，如治療肺炎、肝炎、糖尿病、高血壓和風(fēng)濕病等[2]。其植株含有黃酮、酚、多糖、生物堿等多種成分[3]，其中,黃酮類化合物具有抗菌、消炎、護(hù)肝、利尿、抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶、預(yù)防心血管疾病等效果[4-8]。酚類物質(zhì)是體內(nèi)具有較強(qiáng)生理學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性活性物質(zhì)[7]，具有抗氧化、抗誘變、抗衰老和抗病毒等作用[8-10]，具有廣闊的開發(fā)利用前景。但是，野生金線蓮對(duì)自然環(huán)境的要求十分嚴(yán)格，且因毀滅性的開采，資源遭到嚴(yán)重破壞；而傳統(tǒng)的人工栽培植物生長(zhǎng)緩慢，有效物質(zhì)含量較低，很難滿足市場(chǎng)需求。因此，亟待探尋一種有效生產(chǎn)金線蓮植物材料的方法。

植物組織培養(yǎng)手段是取代傳統(tǒng)的植物材料繁殖的主要途徑[11]，這種方式結(jié)合生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)通過(guò)大量培養(yǎng)植物材料，高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)有效物質(zhì)的目的[12]。目前，金線蓮組培有許多研究報(bào)道，主要通過(guò)研究激素、外植體、光照和培養(yǎng)方式對(duì)金線蓮試管苗的影響，獲得優(yōu)質(zhì)金線蓮種苗[13-14]。但通過(guò)生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)金線蓮有效物質(zhì)的研究較少。生物反應(yīng)器植物器官培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)方式對(duì)培養(yǎng)物生物量的影響很大[15]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，金線蓮叢生芽在無(wú) “載橋”反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，隨著生物量的增加，叢生芽沉積于生物反應(yīng)器底部的氣體分布器上，這些叢生芽在培養(yǎng)中后期變褐，甚至死亡。另外，培養(yǎng)時(shí)期的選擇是有效進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)的重要條件。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和物質(zhì)合成動(dòng)態(tài)研究，可確定適宜的培養(yǎng)周期[16]。此外，在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，許多研究都采用生物和非生物刺激的方法進(jìn)行培養(yǎng)，這種方法是促進(jìn)有效物質(zhì)積累的重要措施[17]，因此，本文在起升式生物反應(yīng)器中不同位置架設(shè)“載橋”后進(jìn)行叢生芽培養(yǎng)，確定最佳的反應(yīng)器培養(yǎng)方式；同時(shí)通過(guò)動(dòng)態(tài)研究篩選適宜金線蓮叢生芽培養(yǎng)的適宜時(shí)期。為提高金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮的含量，采用水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及酵母提取物(YE)等作為誘導(dǎo)子，研究了誘導(dǎo)子種類、處理時(shí)間與處理濃度的影響，篩選最佳的誘導(dǎo)子及其使用方法。

1 材料與方法

1.1 材料

將金線蓮 (Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.) 試管叢生芽接種于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基[13]為3/4MS基本培養(yǎng)基附加 6-芐氨基嘌呤(6-BA)2.0 mg/L + 激動(dòng)素(KT)0.2 mg/L+ 萘乙酸(NAA)0.2 mg/L+ 蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為5.8。在溫度(25±2) ℃，光照強(qiáng)度為1 600 lx，每天光照16 h條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后，將叢生芽切成單體作為該試驗(yàn)的材料。

1.2 方法

1.2.1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式對(duì)叢生芽增殖及總酚與總黃酮含量的影響

利用3 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器，設(shè)置3種培養(yǎng)方式(UN、NB和NM)進(jìn)行叢生芽培養(yǎng)(圖1)。

1) UN：生物反應(yīng)器內(nèi)無(wú)“載橋”；2) NB：在生物反應(yīng)器球體底部架“載橋”；3) NM：在離生物反應(yīng)器球體底部5 cm處架“載橋”。每個(gè)生物反應(yīng)器中加入2 L叢生芽增殖培養(yǎng)基(3/4 MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖35 g/L)，培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為5.8。每個(gè)反應(yīng)器接種20 g(鮮重)的叢生芽外植體，通入氣體400 mL/min。在溫度(25 ±2) ℃，光照強(qiáng)度為1 600 lx，每天光照16 h條件下進(jìn)行培養(yǎng)(下同)。培養(yǎng)30 d后調(diào)查叢生芽生物量(鮮重和干重)，并計(jì)算增殖系數(shù)，同時(shí)測(cè)定叢生芽中總酚和總黃酮含量，并計(jì)算其生產(chǎn)量。增殖系數(shù)和酚及黃酮的生產(chǎn)量按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

增殖系數(shù)=(收獲后叢生芽鮮重-接種叢生芽鮮重)/接種叢生芽鮮重

酚(黃酮)生產(chǎn)量/(mg/L)= 酚(黃酮)含量/(mg/g)×收獲后叢生芽干重/(g/L)

圖1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式

1.2.2 生物反應(yīng)器叢生芽培養(yǎng)動(dòng)態(tài)

采用NB培養(yǎng)方式進(jìn)行研究。將20 g(鮮重)叢生芽外植體接種于含2 L增殖培養(yǎng)基的反應(yīng)器中。從接種第1天開始，每隔5 d收獲叢生芽樣品，直至40 d。通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)期叢生芽總酚和總黃酮的含量及分析其生產(chǎn)量，探明其動(dòng)態(tài)變化，確定最佳的培養(yǎng)周期。

1.2.3 誘導(dǎo)子對(duì)叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

取3 g(鮮重)叢生芽外植體接種于含100 mL叢生芽增殖培養(yǎng)基(液體)的250 mL錐形瓶中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)(振幅為120 rpm)，培養(yǎng)30 d后分別用SA、MeJA和YE進(jìn)行處理。為了篩選最適處理時(shí)間，用500 μM的SA和MeJA分別處理0、4、8、10、12、14、16、20 d，用100 μM的YE處理0、2、4、5、6、8、10 d。之后進(jìn)行誘導(dǎo)子濃度的篩選，SA和MeJA處理濃度設(shè)置為0、400、450、475、500、525、550、600 μM，處理時(shí)間SA為12 d，MeJA為16 d；YE濃度設(shè)置為0、25、50、75、100、125、150 μM，處理時(shí)間為4 d。

最后比較3種誘導(dǎo)子對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)叢生芽中酚及黃酮積累的影響。利用3 L反應(yīng)器，采用NB法培養(yǎng)叢生芽，30 d后，分別加入500 μM的SA處理12 d，525 μM的MeJA處理16 d和75 mg/L的YE處理4 d，以未加誘導(dǎo)子為對(duì)照(CT)。叢生芽收獲后，測(cè)定總酚和總黃酮含量。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生物量的測(cè)定

收獲的叢生芽用自來(lái)水清洗2～3次，除去表面水分并瀝干后稱鮮重。之后，叢生芽放入干燥箱中，45 ℃下干燥48 h，稱干重。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

總酚含量的測(cè)定參照Folin等[18]方法。稱取叢生芽的干燥粉末100 mg，加入80%甲醇15 mL，80 ℃煮2 h，冷卻后4 ℃離心15 min(500 r/min)。取上清液定容至25 mL，利用紫外分光光度計(jì)，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

總黃酮含量的測(cè)定參照吳榮志等[19]方法，稱取叢生芽的干燥粉末100 mg，加入70%乙醇15 mL，60 ℃煮2 h，冷卻后4 ℃離心15 min(500 r/min)。取上清液定容至25 mL，利用紫外分光光度計(jì)，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Excel 2010和SPSS 22軟件進(jìn)行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法(P<0.05)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式對(duì)金線蓮叢生芽增殖及總酚與總黃酮含量的研究

培養(yǎng)方式對(duì)金線蓮叢生芽增殖和總酚與總黃酮含量有顯著影響。在有“載橋”反應(yīng)器(NB和NM)中進(jìn)行叢生芽培養(yǎng)，30 d后發(fā)現(xiàn)叢生芽增殖生長(zhǎng)明顯好于無(wú)“載橋”反應(yīng)器(UN)培養(yǎng)(圖2)。在NB培養(yǎng)方式中，叢生芽鮮重和干重分別達(dá)到142.19和18.71 g，顯著高于NM和UN，且增殖系數(shù)也最高，為13.22(表1)。

UN：無(wú)“載橋”培養(yǎng)；NB和NM：有“載橋”培養(yǎng)

培養(yǎng)方式生物量/g鮮重干重增殖系數(shù)UN87.10±0.49 c13.78±0.60 c7.71±0.05 cNB142.19±2.13 a18.71±0.32 a13.22±0.21 aNM132.33±2.73 b16.81±0.36 b12.23±0.27 b

注：UN：無(wú)“載橋”培養(yǎng)；NB和NM：有“載橋”培養(yǎng)。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。不同字母表示0.05水平上差異顯著，下同。

培養(yǎng)方式對(duì)叢生芽中酚與黃酮積累影響也很大(圖3)。NB與NM培養(yǎng)中，總酚與總黃酮含量無(wú)顯著性差異，2種培養(yǎng)方式中總黃酮含量顯著高于UN；但總酚含量在NB，NM低于UN。對(duì)總酚和黃酮生產(chǎn)量進(jìn)行分析結(jié)果，NB中總酚生產(chǎn)量(46.12 mg/L)與總黃酮生產(chǎn)量(41.44 mg/L)最高，其次為NM(總酚42.12 mg/L,總黃酮37.23 mg/L)，UN最低(總酚37.90 mg/L，總黃酮27.42 mg/L)。因此，NB培養(yǎng)方式也有利于酚和黃酮積累，是生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行金線蓮叢生芽培養(yǎng)的一種適宜培養(yǎng)方式。

圖3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式對(duì)金線蓮叢生芽總酚與總黃酮積累的影響

2.2 生物反應(yīng)器叢生芽培養(yǎng)動(dòng)態(tài)研究

由圖4可知，在金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中，叢生芽中酚與黃酮積累發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在培養(yǎng)30 d內(nèi)，叢生芽中總酚和總黃酮含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而提高，培養(yǎng)第30天時(shí)最大，此時(shí)總酚

含量達(dá)到6.7 mg/g,總黃酮含量達(dá)到4.4 mg/g。但培養(yǎng)天數(shù)超過(guò)30天后，總酚和總黃酮含量呈下降趨勢(shì)。對(duì)總酚和黃酮生產(chǎn)量(叢生芽干重物質(zhì)含量)進(jìn)行分析的結(jié)果與物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致，在培養(yǎng)第30天時(shí)，2種物質(zhì)的生產(chǎn)量均達(dá)到最大，總酚和總黃酮生產(chǎn)量分別為58.8 mg/L和39.2 mg/L。因此，可以確定金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)，30 d為適宜的培養(yǎng)周期。

圖4 金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中酚與黃酮積累的變化

2.3 誘導(dǎo)子對(duì)叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

誘導(dǎo)子處理時(shí)間對(duì)金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮含量有顯著的影響(圖5)。對(duì)于SA，10 d時(shí)總酚和總黃酮含量最高，分別為8.5 mg/g和4.4 mg/g；對(duì)于MeJA，處理16 d時(shí)總酚和總黃酮的含量最高，分別為8.57 mg/g和4.24 mg/g；而對(duì)于YE，處理4 d時(shí)總酚與總黃酮含量最高，分別為7.43 mg/g和5.13 mg/g。

誘導(dǎo)子濃度的影響如圖6所示，SA濃度為500 μM，MeJA濃度為525 μM，而YE濃度為75 mg/L時(shí)，叢生芽中總酚和總黃酮含量最高。

圖5 誘導(dǎo)子處理天數(shù)對(duì)金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

圖6 誘導(dǎo)子處理濃度對(duì)金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

3種誘導(dǎo)子最佳處理時(shí)期和處理濃度確定后，在生物反應(yīng)器叢生芽培養(yǎng)至30 d時(shí)，分別用3種誘導(dǎo)子進(jìn)行處理，通過(guò)總酚和總黃酮含量的測(cè)定，比較了3種誘導(dǎo)子的處理效果。由圖7可見，3種誘導(dǎo)子對(duì)叢生芽中總酚和總黃酮含量均具有促進(jìn)效果，SA、MeJA和YE處理均顯著高于未處理的叢生芽(CT)，但誘導(dǎo)子處理間總酚含量無(wú)顯著性差異。對(duì)于黃酮，MeJA處理中黃酮含量(6.13 mg/g)顯著高于其他處理，依次是SA(4.95 mg/g)和YE(4.71 mg/g)處理。3種誘導(dǎo)子處理的黃酮含量均顯著地高于CT。因此，在金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中，為了提高酚和黃酮的積累，可在叢生芽培養(yǎng)30 d時(shí)加入525 μM的MeJA處理16 d。

圖7 誘導(dǎo)子對(duì)總酚與總黃酮含量影響的比較

3 討論與結(jié)論

利用氣升式反應(yīng)器進(jìn)行金線蓮叢生芽的培養(yǎng)過(guò)程中，由于叢生芽生物量的增加，通氣動(dòng)力難以使叢生芽上浮，導(dǎo)致叢生芽下沉至反應(yīng)器底部，在空氣分布器上堆積，這一方面抑制氣體通入，使培養(yǎng)物無(wú)法隨培養(yǎng)液進(jìn)行流動(dòng)，另一方面又使沉積于底物的叢生芽受到氣體脅迫而影響其進(jìn)一步的生長(zhǎng)[20]。反應(yīng)器內(nèi)架設(shè)支持網(wǎng)(載橋)，有利于植物器官生物反應(yīng)器培養(yǎng)，韓璐等[21]在進(jìn)行白鶴芋組培苗培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)架設(shè)“載橋”得到的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的組培苗，這與本文在反應(yīng)器中架設(shè)“載橋”培養(yǎng)的結(jié)果一致。但是，同樣是反應(yīng)器“載橋”培養(yǎng)，NB的生物量與有效物質(zhì)積累好于NM，這可能是因不同位置的“載橋”對(duì)通入氣體有不同程度的阻遏，導(dǎo)致NB和NM中實(shí)際含氣量不同，從而使叢生芽生物量和物質(zhì)積累出現(xiàn)差異。在利用生物反應(yīng)器進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期培養(yǎng)物中有效物質(zhì)的測(cè)定，可以確定最佳的培養(yǎng)周期。張萬(wàn)博等[22]為了探明生物反應(yīng)器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織中黃酮類物質(zhì)積累的最佳時(shí)期，對(duì)培養(yǎng)5～30 d內(nèi)愈傷組織中黃酮積累的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，最終確定25 d為狼爪瓦松愈傷組織培養(yǎng)的最佳時(shí)間。然而，該研究在進(jìn)行金線蓮生物反應(yīng)器研究時(shí)，培養(yǎng)30 d時(shí)可獲得最多的酚和黃酮，因此，30 d為最佳的培養(yǎng)周期。這種結(jié)果表明，在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)不同植物、不同外植體時(shí)的最佳培養(yǎng)周期不同，應(yīng)針對(duì)不同植物選擇適宜的培養(yǎng)周期。

SA參與植物體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)調(diào)控次生代謝途徑關(guān)鍵酶的活性來(lái)影響次生代謝產(chǎn)物的合成，或通過(guò)增加苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)相關(guān)代謝產(chǎn)物的積累[23]。研究表明，一定濃度SA能有效地提升茜草細(xì)胞中有效物質(zhì)的含量[24]，這與本文研究結(jié)果一致。MeJA可誘導(dǎo)植物體內(nèi)多種抗逆基因的表達(dá)，促進(jìn)各種酶的合成，提高培養(yǎng)物總酚與總黃酮的生產(chǎn)，從而為獲得目標(biāo)次生代謝物提供了有效手段[25]。外源施加MeJA對(duì)葡萄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中總酚含量有明顯促進(jìn)作用[26]，這中結(jié)果本研究中MeJA對(duì)金線蓮叢生芽總酚和總黃酮含量的作用效果相似。YE可活化次生代謝物生物合成相關(guān)酶，提高次生代謝物的積累量。郭雙等[27]研究結(jié)果表明，YE可以提高顛茄毛狀根有效物質(zhì)的積累量。本試驗(yàn)中YE也可提高金線蓮叢生芽總酚與總黃酮的含量，這為YE可作為金線蓮組織培養(yǎng)生產(chǎn)總酚與總黃酮的誘導(dǎo)子提供了理論依據(jù)。通過(guò)比較SA、MeJA和YE，MeJA對(duì)酚和黃酮積累效果最佳，因此，建議在生物反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮叢生芽時(shí)，可用MeJA作為誘導(dǎo)子來(lái)使用。