陳思秀，劉玟妍，高秋月，張馨方，艾金霞，孫麗媛

（北華大學醫(yī)學技術學院，吉林吉林132013）

驢肉具有高蛋白、低脂肪、必需氨基酸豐富等特點，驢肉中礦物元素鐵含量高于其他畜禽肉[1]，而且驢肉中生物價值較高的亞油酸、亞麻酸含量遠遠高于豬肉、牛肉[2]。驢肉營養(yǎng)豐富、味道鮮美、食用價值高，隨著生活水平的提高，人們對驢肉的需求也越來越高。由于驢的飼養(yǎng)周期長，存欄量少，致使驢肉價格上漲。一些不法商家或個人為了追求自身利益用馬、騾、牛、羊甚至豬、雞、鴨肉來冒充驢肉[3]，摻假問題突出，嚴重損害了消費者利益。如2014年沃爾瑪超市摻有狐貍肉的“驢肉”[4]、歐洲的“馬肉風波”。驢肉市場的混亂迫切需要一種科學且簡單、快速的方法對驢肉及驢肉制品進行鑒定，加強對市售驢肉及驢肉制品的檢測鑒別。

驢肉的真?zhèn)舞b別可依據(jù)感官鑒定法[5]、蛋白質(zhì)分析法[6]、ELISA法、分子生物學鑒定。其中，傳統(tǒng)的感官鑒定法主要依據(jù)對肉類的感官和形態(tài)檢驗為主，主觀因素影響較大，且無法對已加工的肉制品進行鑒別；蛋白質(zhì)分析法無法對已深加工、蛋白質(zhì)變性的肉類進行檢測；ELISA法雖然費用較低，且簡單、方便，但容易出現(xiàn)假陽性、假陰性結果。聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）法是常用的分子生物學鑒定方法，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點，但PCR法對實驗環(huán)境和操作人員要求較高，影響因素較多，不適于在基層開展。為使該技術在基層大范圍開展并普及，本科研團隊研發(fā)了驢源性DNA檢測試劑盒，可成功鑒別驢肉真?zhèn)巍?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗樣品 驢肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉等常見生肉樣由長春食品藥品檢測中心提供及本地超市購買。

1.2 實驗試劑 2×Taq PCR MasterMix、洗脫緩沖液TE、100 bp DNA Ladder、λDNA HindIII、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、pGM-T連接試劑盒、pGM-T感受態(tài)細胞均購自北京天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗儀器 ZF型紫外透射反射分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；H-2050R低溫高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；ETC811 PCR基因擴增儀（蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司）；DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；GeneAmp*PCR System 9700 PCR儀（美國Per-kin-Elmer公司）；HH.S精密恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；D1008E手掌型離心機；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）。

1.4 驢源性DNA檢測

1.4.1 驢肉及其他常見肉類DNA提取 取肉樣剪碎約稱取0.05 g，置離心管中。加入P1（Tris-HCl、EDTA、NaCl、10%SDS、PK 酶和 ddH2O）溶液 500 μL，P2（10%SDS）溶液 30 μL，P3（PK 酶）溶液 15 μL混勻，置于56℃水浴振蕩1 h。取出加入P4（飽和乙酸鈉）溶液500 μL，充分混勻10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液加入等體積P5（異丙醇）溶液，-20℃放置1 h。取出后10 000 r/min離心10 min。棄去上清液，沉淀中加入70%冰凍乙醇溶液500 μL，混勻，11 000 r/min離心10 min（重復1次）。棄去上清液，沉淀室溫晾干后，分別加入P6（ddH2O）溶液100 μL溶解DNA，混勻，作為供試品DNA溶液。

1.4.2 DNA濃度、純度檢測 將提取的基因組DNA經(jīng)適當稀釋，用紫外分光光度計測量260 nm和280 nm處的吸光度A260和A280，每個樣品測定3次，取平均值。以A260/A280鑒定DNA的濃度及純度。

1.4.3 PCR引物 在GenBank中下載驢種屬基因序列（GenBank：JF718884.1）、牛種屬基因序列（GenBank：HQ184045.1）、羊種屬基因序列（GenBank：HM236 185.1）、豬種屬基因序列（GenBank：GU135833.1）、雞種屬基因序列（GenBank：GU261717.1）和鴨種屬基因序列（GenBank：KX534428.1），應用NCBI Primer-BLAST在線引物設計軟件設計驢、牛、羊、豬、雞和鴨種屬特異性引物（表1），由深圳華大基因科技服務有限公司合成。

表1 特異性引物序列

1.4.4 PCR擴增反應 優(yōu)化PCR反應體系和反應參數(shù)，確定最適PCR反應體系： 2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物 F、R（10 ng/μL）各 0.5 μL，DNA 模板（100 ng/μL）0.5 μL，無菌ddH2O將體積補足至20 μL于PCR反應管中，放入PCR儀。最適PCR反應參數(shù)：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4.5 PCR產(chǎn)物檢測 取4 μL PCR產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，85 V/cm電泳85 min，停止電泳。將凝膠置于紫外分析儀中觀察，照相。正品驢、牛、羊、豬、雞、鴨肉應在447、256、317、214、398、512 bp處有單一明亮條帶。

1.4.6 種屬特異性基因片段克隆 紫外燈下切下驢肉及其他常見肉類特異性DNA片段，進行凝膠回收；測定其DNA濃度，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后涂板過夜培養(yǎng)；藍白篩選后轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基于37℃恒溫氣浴振蕩器中培養(yǎng)過夜；質(zhì)粒小提，測定其DNA濃度。選取濃度超過100 ng/μL的樣本交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。分析測序結果，并將提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后稀釋一定濃度作為試劑盒的陽性對照。

1.5 驢源性DNA檢測試劑盒組裝 試劑盒為20次用量，包括DNA提取體系和PCR擴增體系。DNA提取體系（表2）：P1、P2、P3是細胞消化液；P4、P5是 DNA 沉淀劑；P6是DNA溶解液。PCR擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 混合酶、引物、無菌雙蒸水、陽性對照（克隆后的驢牛羊豬雞鴨產(chǎn)物）、陰性對照（無菌雙蒸水）。

表2 驢肉DNA檢測試劑盒組成

1.6 驢源性DNA檢測試劑盒的評價

1.6.1 特異性檢測 操作者和實驗員在不知曉待檢樣品真?zhèn)蔚那闆r下使用試劑盒法對隨機編號的1個正品和5個偽品進行盲檢，標準品作為陽性對照。

1.6.2 靈敏度檢測 隨機挑選1個驢肉正品，測量其DNA濃度。依次進行10倍梯度稀釋，直到10-6ng/μL，每個稀釋度各取1 μL作為模板進行PCR擴增，于1.5%瓊脂糖凝膠上，85 V/cm凝膠電泳85 min，將凝膠置于紫外分析儀上拍照。

1.6.3 穩(wěn)定性檢測 隨機挑選1個試劑盒，由-20℃取出，室溫下溶解，再置于-20℃冷凍，如此反復凍融5、10、20次后，對試劑盒內(nèi)的DNA提取試劑，陰、陽性對照樣品進行檢測。

1.6.4 有效期檢測 將試劑盒于-20℃保存，于制備后的當日及每間隔1個月檢測驢肉正品、易混品及陰性對照各1次。

2 結 果

2.1 驢肉等基因組DNA的提取 將所提取的基因組DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，如圖1所示，各泳道均出現(xiàn)明顯條帶，說明驢肉等基因組DNA提取成功。

圖1 驢肉等基因組DNA提取電泳結果

2.2 驢肉及常見肉類DNA的濃度與純度 經(jīng)重復測定，本試劑盒法提取的樣品DNA純度均在1.80～2.10（表3），每個樣本3次測量數(shù)值差異小于0.01，說明試劑盒法提取的DNA純度高，無蛋白質(zhì)污染。

2.3 引物特異性試驗結果 如圖2所示，驢、牛、羊、豬、雞、鴨種屬特異性引物分別在447、256、317、398、214、512 bp處出現(xiàn)特異性條帶。

2.4 克隆結果及比對結果 克隆后所提DNA經(jīng)TM 58℃ PCR擴增后于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，克隆結果與預期目的條帶位置一致，分別在447、256、317、398、214、512 bp出現(xiàn)明顯條帶（圖3）。擴增的目的片段經(jīng)測序后，在NCBI上BLAST比對后，結果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的驢、牛、羊、豬、雞、鴨相似性均為100%，證明克隆的DNA片段即為目的基因片段。

表3 驢肉及常見肉類DNA濃度和純度檢測結果

圖2 引物特異性試驗結果

圖3 重組構建的質(zhì)粒PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.5 驢源性DNA檢測試劑盒評價

2.5.1 特異性檢測 對隨機編號的樣品進行盲檢，正品出現(xiàn)明顯條帶，偽品均未出現(xiàn)條帶，見圖4。

2.5.2 靈敏度檢測 如圖5所示，稀釋到10-3ng/μL時，在447 bp處出現(xiàn)淺帶，小于該濃度則未出現(xiàn)條帶。說明該試劑盒的最低檢測靈敏度為10-3ng/μL。

2.5.3 穩(wěn)定性檢測 試劑盒分別凍融5、10、20次后仍能提取驢肉DNA并擴增出447 bp目標條帶，表明試劑盒有良好的穩(wěn)定性。

圖4 特異性試驗結果

圖5 驢源性DNA檢測試劑盒靈敏度檢測結果

2.5.4 有效期檢測 將試劑盒于-20℃保存1年，12個月中每次檢測結果均一致，說明本試劑盒在-20℃保存條件下，檢測結果準確可靠，至少可保存1年。

3 討 論

驢肉營養(yǎng)價值較高，分子生物學方法鑒定驢肉真?zhèn)卧絹碓绞艿街匾?，常用的分子生物學檢測方法為 PCR法。PCR 法靈敏度高，影響因素較多，比如在配制PCR反應體系時，由于操作者手法不穩(wěn)致使溶液混合不勻；PCR反應體系配置時容易發(fā)生漏加或少加現(xiàn)象，易造成假陰性結果；DNA提取過程中標本的交叉污染可造成假陽性或假陰性結果，因此PCR法的基層普及度不高。

在DNA提取方面，所用試劑較少，且標志清晰不易造成混亂，根據(jù)試劑盒要求，提取肉樣DNA時所需樣本量極微，僅需0.05 g肉樣就可提取出目的DNA，步驟簡便，試劑無毒，安全環(huán)保。在PCR檢測方面，本科研團隊根據(jù)GenBank種屬特異性Cytb靶基因設計特異性引物[7-10]，通過一系列優(yōu)化實驗，最終確定LV等引物在TM為58℃、引物模板量為0.5 μL時最佳，特異性強。選取驢肉等常見肉類特異性條帶進行克隆，經(jīng)測序在NCBI上BLAST比對后相似性均為100%，測濃度后稀釋到10 ng/μL作為陽性對照。本試劑盒提前將除DNA模板外的PCR反應體系全部加至Eppendorf管中，操作者只需在配好的PCR反應體系中加入待檢的DNA提取液即可進行下一步驟，以防操作者漏加或多加，最大程度減少PCR加樣過程中的操作誤差。本試劑盒檢測驢肉正品、市售驢肉及偽品，正品均在447 bp處出現(xiàn)明顯條帶，偽品未出現(xiàn)條帶，簡單方便。靈敏度試驗表明本試劑盒的最低檢測限為10-3ng/μL。本試劑盒于-20℃條件下反復凍存最少20次，具有良好的穩(wěn)定性，可于-20℃條件下保存1年。

4 小 結

本試劑盒法提取肉類及肉制品DNA、PCR反應、瓊脂糖凝膠電泳等一些列試驗，可在6 h內(nèi)完成，在1次實驗中能鑒別出待檢驢肉中是否為驢源性成分，是否摻有牛、羊、豬、雞、鴨源性成分。相較熒光PCR法鑒定肉類及肉制品，該試劑盒價格便宜，無需購買熒光PCR熒光探針、特定儀器等，減輕經(jīng)濟負擔；該法操作簡單方便，可大大減少質(zhì)檢工作人員的工作量。試劑盒法準確度高、特異性好、靈敏度強、穩(wěn)定性高，可廣泛應用到驢肉的質(zhì)量監(jiān)督工作中。