陳冠希，劉 明，張宏福，郭振東，劉林娜，劉靜波,*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春130122）

隨著畜牧業(yè)機(jī)械化程度的提高，我國生豬養(yǎng)殖行業(yè)已逐步向規(guī)?；⒓s化、標(biāo)準(zhǔn)化和自動化的現(xiàn)代養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)型，生豬養(yǎng)殖效率顯著提高。將豬舍內(nèi)環(huán)境溫度和濕度控制在適宜范圍內(nèi)是改善生豬生長性能的重要途徑，而全封閉豬舍是實(shí)現(xiàn)舍內(nèi)溫度和濕度可控的主要手段。全封閉豬舍雖可顯著提高生豬養(yǎng)殖的效率和密度，但通風(fēng)不足時(shí)會導(dǎo)致舍內(nèi)空氣質(zhì)量顯著降低，而長期暴露于該環(huán)境下將會損害飼養(yǎng)人員和動物的健康以及動物的生長發(fā)育[1]。前期研究表明，封閉式畜禽舍內(nèi)高濃度的有毒有害氣體（如氨氣和硫化氫等）會導(dǎo)致畜禽免疫力低下、食欲減退以及生長性能降低[2]。此外，飼養(yǎng)活動以及動物的自身活動會使畜禽舍內(nèi)的大量粉塵微粒懸浮于空氣中，懸浮的顆粒物與微生物結(jié)合之后形成微生物氣溶膠[3]。具有不同顆粒大小的微生物氣溶膠通過呼吸道進(jìn)入動物的肺部和血液后可引發(fā)各種疾病，從而對動物生產(chǎn)造成顯著的負(fù)面影響，且顆粒物直徑越小危害越大[4]。

目前，長期處于規(guī)?；i舍空氣環(huán)境對人和家畜危害的研究在國內(nèi)相對較少，豬場環(huán)境顆粒物對人和家畜機(jī)體的損傷效應(yīng)研究尚不深入。因此本試驗(yàn)通過采集封閉式育肥豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物樣品，以小鼠為動物模型，采用滴鼻方式模擬動物呼入過程，用以研究豬舍環(huán)境顆粒物對小鼠肺組織損傷的影響，旨在對于家畜健康養(yǎng)殖及飼養(yǎng)員自我防護(hù)提供重要指導(dǎo)和借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 封閉式育肥豬舍環(huán)境顆粒物樣品采集和洗脫 環(huán)境顆粒物樣品采集于貴州省某規(guī)?；忾]式育肥豬舍內(nèi)，將大容量空氣采樣器（華瑞核安）置于舍內(nèi)中央位置，高度1.0 m，采樣流量1 000 L/min，采集時(shí)間24 h。采樣濾膜為石英膜（Pall，19.8 cm×23.8 cm），采樣后將膜密封避光-20℃保存。舍內(nèi)環(huán)境顆粒物總質(zhì)量濃度根據(jù)稱量采樣前后膜質(zhì)量差除以采樣空氣量計(jì)算，該豬場育肥舍的空氣顆粒物質(zhì)量濃度為1 934.8 μg/m3。使用去離子水在50 mL離心管中洗脫剪取的1/4采樣膜，洗脫過程中將離心管置于冰上超聲震蕩20 min，使膜上的顆粒物樣品充分洗脫融入溶液（圖1）。

圖1 封閉式豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物樣品采集及處理流程

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將30只6周齡的BALB/C 雌性小鼠隨機(jī)分成3個(gè)處理組，即對照組、生理鹽水滴鼻組和顆粒物滴鼻組，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)。每日09:00用電子天平對小鼠進(jìn)行稱重后記錄體重，09:30用乙醚輕度麻醉生理鹽水滴鼻組小鼠后，用移液器吸取50 μL生理鹽水滴入小鼠鼻腔，使其在自主呼吸狀態(tài)下將生理鹽水吸入肺中。與此同時(shí)，用乙醚輕度麻醉顆粒物滴鼻組小鼠后，使用移液器吸取50 μL顆粒物樣品溶液滴入小鼠鼻腔，使其在自主呼吸狀態(tài)下將樣品溶液吸入肺中，每日小鼠吸入的顆粒物質(zhì)量為696.5 μg。以小鼠呼吸量為60 mL/min計(jì)算[5]，每日滴入小鼠鼻腔樣品量為小鼠呼吸4 d總懸浮物空氣的質(zhì)量，試驗(yàn)處理持續(xù)1周，模擬持續(xù)呼吸28 d總懸浮物空氣的中長期暴露情況。

1.3 樣品采集 于試驗(yàn)第3天和第7天11:00在每個(gè)組中隨機(jī)選取5只小鼠采用尾靜脈采血法采集小鼠足量血液用于血常規(guī)分析。采血后麻醉處死小鼠，解剖取肺部組織樣品，用于制作病理切片和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的測定。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 小鼠體況 根據(jù)試驗(yàn)期間每天記錄的小鼠體重分析小鼠體重變化。

1.4.2 小鼠肺部病理變化 將肺部組織樣品置于福爾馬林溶液中，用于制作病理切片觀察小鼠肺組織病理損傷。

1.4.3 小鼠肺部細(xì)胞因子表達(dá) 采用Trizol法提取肺部組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于熒光定量PCR方法定量肺組織內(nèi)腫瘤壞死因子（TNF-α）、干擾素（IFN-γ）、白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、白介素-12（IL-12）等重要細(xì)胞因子表達(dá)情況。所定量基因及引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4.4 血液常規(guī)生化指標(biāo)測定 采用美國BACKMA COHIFER A4680全自動生化分析儀及相關(guān)配套試劑分析測定小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中間細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞百分比、中間細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、血小板分布寬度、血小板壓積、大血小板細(xì)胞比率、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差、血小板數(shù)目、平均血小板體積。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SAS9.3統(tǒng)計(jì)軟件分析均符合正態(tài)分布并進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果以P＜0.05為差異顯著，P＜0.10為有趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 封閉式育肥豬舍環(huán)境顆粒物滴鼻對小鼠體重的影響對照組、生理鹽水滴鼻組和顆粒物滴鼻組小鼠的初始平均體重分別為19.3、19.3、19.0 g。由圖2可知，試驗(yàn)期間，對照組和生理鹽水滴鼻組小鼠體重穩(wěn)步上升，在第7天，對照組小鼠平均體重上升6.6%，生理鹽水滴鼻組小鼠平均體重上升4.5%。而顆粒物滴鼻組小鼠的體重先劇烈下降，至第3天達(dá)到最低（下降10.3%），隨后逐步回升，第7天平均體重較初始體重下降2.2%。在第2～7天，顆粒物滴鼻組小鼠的體重均顯著低于對照組和生理鹽水滴鼻組（P＜0.05）。

圖2 封閉式豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物滴鼻對小鼠體重的影響

2.2 封閉式育肥豬舍環(huán)境顆粒物對小鼠肺組織病理影響如圖3所示，對照組和生理鹽水滴鼻組肺組織病理無明顯變化。顆粒物滴鼻組小鼠第3天的肺組織病變明顯，表現(xiàn)為彌漫性肺泡壁增厚，肺泡上皮細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，個(gè)別細(xì)胞壞死，肺泡結(jié)構(gòu)幾乎消失（a），在肺中彌散分布著壞死灶（b）。有大量的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤在肺泡間質(zhì)（c）。細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞變性壞死脫落、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞阻塞細(xì)支氣管（d），間質(zhì)纖維輕度增生（e）。顆粒物滴鼻組第7天的小鼠肺組織病變明顯，但較第3天病理變化輕微。彌漫性肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)幾乎消失，肺泡上皮細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，個(gè)別細(xì)胞壞死（a）。有中度淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤在肺泡間質(zhì)（c）。細(xì)支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落。少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞存在于細(xì)支氣管中（d）。

圖3 封閉式豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物滴鼻對小鼠肺組織病理影響

2.3 封閉式育肥豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物對小鼠肺部組織細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響 如圖4所示，在第3天，顆粒物滴鼻組小鼠肺組織內(nèi)IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12表達(dá)水平顯著高于對照組和生理鹽水滴鼻組（P＜0.05），較對照組分別顯著上調(diào)11.9、323.6、306.3、624.3、11.8倍。第7天，顆粒物滴鼻組小鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-4和IL-6較對照組和生理鹽水組顯著升高（P＜0.05），較對照組分別顯著上調(diào)12.0、6.2、7.6、5.2倍。

2.4 封閉式育肥豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物滴鼻對小鼠血液生化指標(biāo)的影響 由表2、3可知，各處理組小鼠白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中間細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞百分比、中間細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、血小板分布寬度、血小板壓積、大血小板細(xì)胞比率、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差、血小板數(shù)目、平均血小板體積無顯著變化（P＞0.05）。

3 討 論

圖4 小鼠肺組織細(xì)胞因子相對表達(dá)量

豬場環(huán)境中含有多種氣體、化學(xué)物質(zhì)、顆粒物、細(xì)菌、粉塵等[6-8]，長期處于這樣的環(huán)境會造成飼養(yǎng)人員和畜禽的機(jī)體損傷，同時(shí)也影響畜禽的生產(chǎn)水平。目前，針對各種有毒氣體對動物生產(chǎn)性能影響的研究較多[9-10]，舍內(nèi)顆粒物對動物機(jī)體損傷和生產(chǎn)性能的影響研究較少。在現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)中，封閉式豬舍內(nèi)空氣流速緩慢，使得豬舍內(nèi)空氣顆粒物濃度明顯升高。呼吸系統(tǒng)作為機(jī)體與外界環(huán)境物質(zhì)交換的門戶受到威脅。顆粒物測定指標(biāo)是可吸入顆粒物（PM10）以及細(xì)顆粒物（PM2.5），其危害程度主要取決于粒徑大小、表面積以及化學(xué)組成。

本研究發(fā)現(xiàn)，封閉式育肥豬舍內(nèi)空氣顆粒物最高濃度可達(dá)1 934.8 μg/m3，該質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過《國家空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[11]中總懸浮顆粒物濃度的二級標(biāo)準(zhǔn)300 μg/m3。以含有該顆粒物濃度的溶液滴鼻感染小鼠，小鼠在前3 d反應(yīng)劇烈，呈現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，體重驟減，隨后機(jī)體逐漸適應(yīng)該成分轉(zhuǎn)為慢性炎癥反應(yīng)，體重有所回升，但仍明顯低于正常小鼠體重。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在第3天，顆粒物滴鼻組小鼠肺組織內(nèi)IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12表達(dá)水平較對照組分別顯著上調(diào)11.9、323.6、306.3、624.3、11.8倍；在第7天，顆粒物滴鼻組小鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-4和IL-6較對照組和生理鹽水組顯著升高，分別是對照組的12.0、6.2、7.6和5.2倍。TNF-α具有促炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展并調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)的功能，譬如炎性骨吸收、程序性細(xì)胞死亡和自身免疫疾病等[12]，已被證明與慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合癥等肺部疾病發(fā)病有一定關(guān)系[13]，在肺急性呼吸窘迫綜合征和肺癌組織中明顯上調(diào)表達(dá)[14-15]。IL-6在炎癥反應(yīng)中作為重要遞質(zhì)起核心調(diào)節(jié)作用，有研究報(bào)道表明大氣PM2.5成分可以顯著刺激鼠肺組織中IL-6的超表達(dá)，并且PM2.5可以通過IL-6通路上調(diào)肺上皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)[16]。與TNF-α和IL-6不同的是，IL-10是一種抗炎癥與免疫抑制細(xì)胞因子。在顆粒物滴鼻后第3天，小鼠肺內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-10同時(shí)超表達(dá)，說明肺組織免疫系統(tǒng)紊亂、損傷嚴(yán)重。上述結(jié)果與病理學(xué)觀察結(jié)果一致，顆粒物滴鼻組的小鼠肺部病變在第3天較第7天嚴(yán)重，有中度淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤在肺泡間質(zhì)，出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，肺中彌散分布著壞死灶。本試驗(yàn)中，顆粒物滴鼻組小鼠肺部出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，然而小鼠血液中的炎癥細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化，可能是因?yàn)轭w粒物損傷肺部引發(fā)流血產(chǎn)生細(xì)胞因子，循環(huán)血中炎癥細(xì)胞數(shù)量不能直接反映局部炎癥反應(yīng)。

表2 試驗(yàn)第3天小鼠血液生化指標(biāo)

表3 試驗(yàn)第7天小鼠血液生化指標(biāo)

4 結(jié) 論

試驗(yàn)證明，封閉式育肥豬舍內(nèi)環(huán)境顆粒物對小鼠機(jī)體有明顯的損傷作用。將封閉式育肥豬舍環(huán)境顆粒物滴鼻對小鼠體重有顯著影響；而且對肺組織有明顯的病理損傷及炎癥反應(yīng)，肺組織重要細(xì)胞因子mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，長期處于如此高濃度空氣顆粒物質(zhì)量濃度的空氣環(huán)境中容易引發(fā)多種肺部疾病。