汪 洋，王秀英，汪龍梅，代 兵，劉秀婷，劉玉蘭*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430023；2.浙江國(guó)正檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江杭州310030）

“免疫應(yīng)激”在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在，免疫應(yīng)激雖能激活免疫系統(tǒng)以抵抗外來(lái)病原對(duì)機(jī)體的損傷，但免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活會(huì)消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致豬生長(zhǎng)受阻，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[1]。免疫應(yīng)激與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]，因此適當(dāng)抑制炎癥反應(yīng)是緩解免疫應(yīng)激的重要手段之一。

細(xì)胞死亡方式包括自噬、凋亡和壞死。最初人們認(rèn)為，細(xì)胞壞死是極端情況下的純粹被動(dòng)和不受控制的細(xì)胞死亡類(lèi)型，但是后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞壞死是可以受到信號(hào)調(diào)控的。近年來(lái)，一種與炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞死亡方式——程序性壞死[2]引起廣泛關(guān)注。程序性壞死可導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破損和胞內(nèi)的酶等活性物質(zhì)外溢，引起周?chē)M織的炎癥反應(yīng)。程序性壞死引起的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致許多疾病發(fā)生的重要因素[3-4]。受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）和RIP3是介導(dǎo)程序性壞死的2個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子。Necrostatin-1（Nec-1）是程序性壞死阻斷劑，可以與RIP1信號(hào)分子特異性結(jié)合，使RIP1不能與RIP3分子發(fā)生交互作用，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)的程序性壞死信號(hào)通路不能完成，最終抑制細(xì)胞的程序性壞死[2-3]。小鼠模型上的研究已證實(shí)，Nec-1在缺血再灌注和炎癥等多種因素導(dǎo)致的組織（如腦、脊髓、腸道）損傷或壞死中發(fā)揮保護(hù)作用[3-5]，但是目前在豬上的研究未見(jiàn)報(bào)道。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的毒性成分，能刺激仔豬機(jī)體產(chǎn)生急性免疫應(yīng)激反應(yīng)，并可引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥[1,6]。最近研究表明，LPS可以誘導(dǎo)程序性壞死[7]。鑒于此，推測(cè)Nec-1可能通過(guò)抑制程序性壞死，從而抑制或緩解LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)。本試驗(yàn)研究Nec-1對(duì)斷奶仔豬血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和血液生化指標(biāo)的影響，旨在探究Nec-1是否可以緩解仔豬免疫應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而提高養(yǎng)豬生產(chǎn)水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 二甲基亞砜（DMSO）有效成分＞99.5%，BioFroxx公司提供，注射時(shí)溶于PBS中配制成10% DMSO溶液，按0.66 mL/kg體重（BW）腹膜注射。Nec-1有效成分＞98%，MedChem Express公司提供，溶于純DMSO中配成50 mg/mL，再加入PBS稀釋?zhuān)⑸湟褐蠨MSO含量均為10%，Nec-1含量分別為5、1.51、0.5 mg/mL，按0.66 mL/kg BW腹膜注射，即3.3、1.0、0.33 mg/kg BW。LPS、大腸桿菌血清型055: B5由Sigma公司提供，注射時(shí)溶解于0.9% NaCl溶液。注射液中LPS含量為500 μg/mL，按0.2 mL/kg BW腹膜注射，即100 μg/kg BW。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇（28±1）日齡、平均體重（9.21±0.66）kg的杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬25頭，分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。5個(gè)處理組分別為對(duì)照組（10% DMSO+生理鹽水）、LPS組（10%DMSO+LPS）、0.33 Nec-1組（0.33 mg/kg BW Nec-1+LPS）、1.0 Nec-1組（1.0 mg/kg BW Nec-1+LPS）和3.3 Nec-1組（3.3 mg/kg BW Nec-1+LPS）。0.33 Nec-1組、1.0 Nec-1組和3.3 Nec-1組注射對(duì)應(yīng)濃度的Nec-1，對(duì)照組和LPS組注射10% DMSO溶液。注射N(xiāo)ec-1或10% DMSO 30 min后，對(duì)照組注射生理鹽水，其他組注射100 μg/kg BW LPS，分別在注射LPS或生理鹽水4 h和24 h后采血液樣品待測(cè)。

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在湖北奧登農(nóng)牧科技有限公司天門(mén)市豬場(chǎng)進(jìn)行。豬舍溫度為25～27℃，教槽料飼喂，自由飲水。LPS注射后仔豬因應(yīng)激導(dǎo)致采食量下降，本試驗(yàn)為了減少各組因采食量的不同而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，對(duì)照組仔豬的飼喂量根據(jù)LPS組仔豬的采食量確定。

1.4 樣品采集 在注射LPS或生理鹽水4 h和24 h后，從仔豬前腔靜脈采血。EDTA管收集3 mL血樣用于血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)測(cè)定。用血漿管采血8 mL，3 000 r/min離心10 min，獲得的血漿保存于-80℃超低溫冰箱用于生化指標(biāo)測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù) 血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)采用Siemens ADVIA? 2120i全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定。

1.5.2 血漿生化指標(biāo) 血漿生化指標(biāo)采用HITEC 7100全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，測(cè)定方法參照石海峰等[6]方法。1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較。LPS組與對(duì)照組相比較，以確定LPS刺激的影響；LPS組與不同濃度的Nec-1組相比較，以確定注射不同劑量的Nec-1對(duì)LPS刺激仔豬的影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值和SEM表示。以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.10表示具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 Nec-1對(duì)LPS刺激仔豬血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)的影響 由表1可知，注射LPS 4 h后，與對(duì)照組相比，LPS組白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞絕對(duì)值、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值、嗜堿性粒細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞比例、血小板和血小板容積比顯著降低（P＜0.05），紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板分布寬度顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，1.0 Nec-1組可以顯著提高紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（P＜0.05），0.33 Nec-1、1.0 Nec-1和 3.3 Nec-1組均可顯著緩解LPS刺激導(dǎo)致的血小板分布寬度升高（P＜0.05）。

注射LPS 24 h 后，與對(duì)照組相比，LPS組單核細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞比例、單核細(xì)胞比例、嗜堿性粒細(xì)胞比例、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、血小板和血小板容積比顯著降低（P＜0.05），白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值、嗜中性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例、血小板平均體積和血小板分布寬度顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，3種濃度Nec-1處理均可減輕LPS刺激導(dǎo)致的嗜酸性粒細(xì)胞比例升高（P＜0.05），0.33 Nec-1和3.3 Nec-1組降低了嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值（P＜0.05），1.0 Nec-1組有降低嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值的趨勢(shì)（P=0.061）。

2.2 Nec-1對(duì)LPS刺激仔豬血漿生化指標(biāo)的影響 由表2可知，注射LPS 4 h 后，與對(duì)照組相比，LPS組血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性和AST/谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）顯著升高（P＜0.05），葡萄糖、總蛋白、白蛋白含量和肌酸激酶活性顯著降低（P＜0.05）。與LPS組相比，0.33 Nec-1組緩解了LPS刺激導(dǎo)致的AST活性和AST/ALT的升高（P＜0.05），1.0 Nec-1組緩解了葡萄糖含量和肌酸激酶活性的降低（P＜0.05）。

表1 Nec-1對(duì)LPS刺激的仔豬血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)的影響

續(xù)表1

注射LPS 24 h后，與對(duì)照組相比，LPS組血漿AST活性、AST/ALT和尿素含量顯著升高（P＜0.05），葡萄糖、白蛋白、總膽固醇含量和肌酸激酶活性顯著降低（P＜0.05）。與LPS組相比，0.33 Nec-1組緩解了肌酸激酶活性的降低并提高了總膽固醇和甘油三酯含量（P＜0.05），1.0 Nec-1組有緩解LPS刺激導(dǎo)致的AST/ALT升高的趨勢(shì)（P＜0.10），3.3 Nec-1組可以緩解AST/ALT升高和葡萄糖含量的降低（P＜0.05），并有緩解總膽固醇含量降低和AST活性升高的趨勢(shì)（P＞0.05）。

3 討 論

LPS作為一種熱穩(wěn)定的毒素，可以誘導(dǎo)仔豬在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生細(xì)菌感染癥狀，并且可以誘導(dǎo)程序性壞死[1,7-8]。在結(jié)腸炎相關(guān)的腫瘤小鼠模型中，Nec-1可以顯著緩解炎性細(xì)胞因子的過(guò)量產(chǎn)生，減輕結(jié)腸炎癥，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展[4]。因此，推測(cè)Nec-1對(duì)LPS刺激導(dǎo)致的斷奶仔豬免疫應(yīng)激有緩解作用。

血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)一般包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的計(jì)數(shù)。白細(xì)胞包含嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。白細(xì)胞總數(shù)及其分類(lèi)計(jì)數(shù)的變化可以反映機(jī)體的炎癥狀態(tài)[9]。嗜酸性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性的超氧化物及溶酶體酶等。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏、傳染病等因素均可導(dǎo)致機(jī)體嗜酸性粒細(xì)胞比例升高，且嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量和與之相關(guān)的疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[10]。紅細(xì)胞主要為機(jī)體運(yùn)輸氧，其中，血紅蛋白是紅細(xì)胞的組成部分[6]。血小板參與凝血，也可以釋放氧自由基達(dá)到抗菌的作用，還可產(chǎn)生趨化因子，促進(jìn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)[11]，其中，血小板分布寬度與代謝綜合征相關(guān)[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射LPS后，血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)發(fā)生了顯著的變化，這些結(jié)果與石海峰等[6]結(jié)果相似，說(shuō)明LPS刺激會(huì)導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生急性免疫應(yīng)激反應(yīng)。注射LPS 24 h后，3種濃度Nec-1緩解了LPS刺激導(dǎo)致的嗜酸性粒細(xì)胞比例的升高，0.33 mg/kg BW Nec-1和3.3 mg/kg BW Nec-1降低了嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值，1.0 mg/kg BW Nec-1有降低嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值的趨勢(shì)。有研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞可以分泌嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白，這種蛋白參與宿主的免疫防御，可以與LPS特異性結(jié)合起到抗菌作用[13]。LPS引起的嗜酸性粒細(xì)胞升高的具體原因目前尚未見(jiàn)報(bào)道，這可能與機(jī)體的自身調(diào)節(jié)有關(guān)，但需要進(jìn)一步研究。Nec-1可能通過(guò)阻滯程序性壞死信號(hào)通路以減輕炎癥，從而緩解了LPS導(dǎo)致的負(fù)面影響。

血液生化指標(biāo)可在一定程度上顯示機(jī)體整體代謝的情況，也可用于推斷某些組織或器官的健康狀態(tài)。血液中ALT和AST活性可反映肝功能狀態(tài)，這2種酶活性的升高常見(jiàn)于組織損傷中[14]。本試驗(yàn)中，0.33 mg/kg BW Nec-1和3.3 mg/kg BW Nec-1分別緩解了LPS刺激4 h和24 h后AST和AST/ALT的升高，表明Nec-1具有保護(hù)肝臟的作用。與此類(lèi)似，在創(chuàng)傷性誘發(fā)出血性休克大鼠上的研究也發(fā)現(xiàn)Nec-1可以降低AST和ALT活性[15]。Kim等[7]發(fā)現(xiàn)，Nec-1可降低ALT活性，抑制Toll樣受體4信號(hào)通路，緩解D-氨基半乳糖/LPS誘導(dǎo)的程序性壞死和急性肝損傷。

表2 Nec-1對(duì)LPS刺激仔豬血漿生化指標(biāo)的影響

此外，其他血液生化指標(biāo)也具有重要意義，可反映機(jī)體的生理狀況。血糖水平直接反映了機(jī)體對(duì)日糧中碳水化合物的吸收效率[14]；甘油三酯水平的高低可反映機(jī)體對(duì)脂類(lèi)的吸收狀況[16]；膽固醇是維生素D合成的前體物質(zhì)，也是血液中脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子[16]；肌酸激酶可以促進(jìn)機(jī)體磷酸肌酸與ADP反應(yīng)生成ATP和肌酸來(lái)保證組織細(xì)胞能量供應(yīng)，是機(jī)體能量代謝的重要酶類(lèi)[17]。本研究表明，LPS刺激降低了葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇和肌酸激酶水平，說(shuō)明LPS刺激會(huì)影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用，阻礙能量代謝，這與本課題的前期研究結(jié)果相似[6,18-19]。本試驗(yàn)中，Nec-1提高了葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯水平并緩解了肌酸激酶活性降低，說(shuō)明Nec-1能在一定程度上緩解LPS刺激導(dǎo)致的血液生化指標(biāo)的變化。

不同Nec-1劑量對(duì)機(jī)體的影響具有較大的區(qū)別，這可能是因?yàn)?個(gè)劑量的Nec-1（3.3、1.0、0.33 mg/kg BW）濃度差距大。此外，與小鼠上Nec-1的效果相比[3-4]，本試驗(yàn)中Nec-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的仔豬應(yīng)激反應(yīng)，尤其是對(duì)血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)的變化僅體現(xiàn)出輕微的緩解作用，其原因可能包括2個(gè)方面：①Nec-1注射液是懸濁液，其中高濃度的3.3 mg/kg BW Nec-1溶解度并不理想，這可能影響了機(jī)體對(duì)Nec-1的吸收；②本試驗(yàn)選擇的Nec-1注射劑量及Nec-1與LPS注射時(shí)間間隔（30 min）是參考了小鼠實(shí)驗(yàn)[3-4]，再根據(jù)黃繼漢等[20]提供的小鼠和豬之間的等效劑量換算公式得出，因此，Nec-1劑量可能不是作用仔豬的最適宜劑量，其時(shí)間間隔是否合理也需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

LPS刺激會(huì)引起斷奶仔豬血細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)和血液生化指標(biāo)的變化，而Nec-1可一定程度緩解LPS刺激導(dǎo)致的負(fù)面影響，這說(shuō)明LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激反應(yīng)可能與程序性壞死相關(guān)，Nec-1可能通過(guò)抑制程序性壞死來(lái)緩解豬的免疫應(yīng)激，進(jìn)而提高養(yǎng)豬生產(chǎn)水平，但具體的作用機(jī)理還需進(jìn)一步探索。