謝雙德 魏姍姍 張華年 王桂松 彭學(xué)標(biāo) 趙 珂 李俊灝 賴 寬

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種多發(fā)于青年女性的可累及全身多臟器的自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是血清中存在以抗核抗體、抗ds-DNA抗體為代表的多種自身抗體。發(fā)病機(jī)制主要為T、B淋巴細(xì)胞功能異常引起機(jī)體免疫功能紊亂，產(chǎn)生大量自身抗體。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路通過自噬調(diào)控、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)參與SLE的發(fā)病過程。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種不同的復(fù)合物，mTORC1激活后通過磷酸化下游靶點(diǎn)(p70S6激酶)參與調(diào)控mRNA翻譯[1]。激活的mTOR通路是SLE患者出現(xiàn)T、B淋巴細(xì)胞異?；罨年P(guān)鍵因素[2]。Th17淋巴細(xì)胞亞群在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，活動(dòng)期 SLE 患者外周血中 Th17 淋巴細(xì)胞比例升高，產(chǎn)生 IL-17 能力增強(qiáng)[3]。有研究表明：在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬皮病、干燥綜合征和SLE等自身免疫性疾病中，mTOR通路與Th17淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系密切。為了探討mTORC1信號(hào)通路及Th17淋巴細(xì)胞亞群在狼瘡鼠發(fā)病中的作用及相關(guān)性，我們對(duì)狼瘡鼠體內(nèi)mTORC1信號(hào)通路及Th17淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組選用6只B6.MRL/lpr狼瘡小鼠，20周齡，質(zhì)量25～30 g，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。對(duì)照組選用6只正常C57小鼠，20周齡，質(zhì)量25～30 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 小鼠IL-17 ELISA試劑盒(武漢六合生物技術(shù)有限公司)、RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)兔抗鼠mTOR單克隆抗體、兔抗鼠p-mTOR(2448)單克隆抗體、兔抗鼠p70S6K單克隆抗體、兔抗鼠p-p70S6K單克隆抗體(均是美國(guó)CST公司)、羊抗鼠IL-17抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)、鼠抗鼠AKT單克隆抗體(Proteintech公司)、Western制膠試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本制備 將兩組小鼠麻醉取血處死后，腹部正中線切開，切取脾臟冰上放置，用于制備淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；切取小鼠的腎臟用于mRNA和蛋白水平測(cè)定。

1.3.2 流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)Th17(CD4+IL-17+T)細(xì)胞 無菌條件下制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液[要求細(xì)胞濃度為(0.5～1)×107/mL]；加入Cell Stimulation Cocktail(eBioscience, San Jose, USA)，用Staining buffer(eBioscience)洗滌；加入CD4抗體，4℃避光孵育30 min，Staining buffer(eBioscience)洗滌；加入FIX工作液，渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，Permeabilization Buffer (eBioscience)洗滌；加入IL-17A抗體，4℃避光孵育30 min，Permeabilization Buffer (eBioscience)洗滌；200 μL Staining buffer(eBioscience)重懸細(xì)胞，BDcalibur(eBioscience)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠腎臟Akt、mTOR、p70S6K和IL-17的mRNA表達(dá) 用Trizol(Life Technologies)一步法提取50 mg小鼠腎臟的總mRNA，超微量分光光度計(jì)稀釋RNA濃度并定量到1 μg/μL，反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green(Takara)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)；反應(yīng)參數(shù)：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)所用的引物如表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting檢測(cè)小鼠腎臟Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白表達(dá) 稱量小鼠腎臟50 mg，剪碎后加入500 μL冷Lysis Buffer(含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、PMSF，凱基生物有限公司)，勻漿，離心后得蛋白提取物；采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度；6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳，蛋白分離后小分子200 mA、大分子350 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。室溫下5%脫脂奶粉封閉膜2 h，用含5%BSA稀釋的一抗4℃孵育膜過夜，洗滌后用含5% BSA稀釋的HRP偶聯(lián)的二抗(1∶1000)室溫孵育2 h。洗滌后發(fā)光預(yù)覽；調(diào)節(jié)曝光時(shí)間；調(diào)整圖片并輸出。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS20.0軟件處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，或者單因素方差分析。RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行2-△△CT計(jì)算得到(△CT值=目標(biāo)基因CT值-內(nèi)參基因CT值；△△CT值=實(shí)驗(yàn)組△CT值-對(duì)照組△CT值)轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠脾臟Th17淋巴細(xì)胞亞群 狼瘡鼠組的Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例[Th17/CD4+T，(10.89±1.69)%]顯著高于正常對(duì)照組的(2.56±0.36)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組小鼠脾臟Th17淋巴細(xì)胞亞群的比例

2.2 RT-PCR檢測(cè)腎臟組織Akt、mTOR、p70S6k、IL-17 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比，狼瘡鼠組Akt、mTOR、p70S6K、IL-17的mRNA表達(dá)水平[Akt：3.31±1.03%、mTOR:(3.59±0.46)%、p70S6K:(1.98±0.41)%、IL-17:(8.15±1.26)%]均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組小鼠腎臟Akt、mTOR、p70S6K、IL-17mRNA的表達(dá)情況

2.3 Western blot檢測(cè)腎臟組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達(dá) 根據(jù)狼瘡鼠腎臟提取的組織蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，檢測(cè)到Akt、mTOR、p70S6K反應(yīng)條帶分別位于56、289、70 ku處，內(nèi)參β-actin反應(yīng)條帶位于43 ku處，與預(yù)期結(jié)果相同。與對(duì)照組相比，狼瘡鼠組的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白條帶著色較深。見圖3。

圖3 兩組小鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達(dá)

3 討論

CD4+T細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞，Th17細(xì)胞是由Park等[4]發(fā)現(xiàn)的新的T細(xì)胞亞群，以選擇性分泌IL-17為特征，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性炎性腸病、系統(tǒng)性硬皮病及SLE等自身免疫病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用；Yang等[3]研究顯示，活動(dòng)期SLE患者外周血中Th17淋巴細(xì)胞比例升高，產(chǎn)生 IL-17 能力增強(qiáng)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：狼瘡鼠動(dòng)物模型腎臟組織RORγt、IL-17mRNA表達(dá)量較正常小鼠增多[5](RORγt是調(diào)控Th17細(xì)胞分化及IL-17分泌的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[6])。在本次實(shí)驗(yàn)中，狼瘡鼠動(dòng)物模型Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例及腎臟組織中IL-17mRNA表達(dá)量均高于正常小鼠，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)人體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)Th17、IL-17在SLE發(fā)病中的致病作用。

mTOR是存在于真核細(xì)胞中的一類絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，以兩種不同形式的復(fù)合物存在：mTORC1和mTORC2。其中，mTORC1主要與細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)、能量和細(xì)胞因子等信號(hào)相關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞增殖或自噬。mTORC1可被多種途徑所激活，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7](氨基酸、葡萄糖)、生長(zhǎng)因子(胰島素)、氧化還原作用等[8]。mTORC1被激活后可通過不同途徑調(diào)控核糖體生成和mRNA轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)糖酵解、磷酸戊糖途徑及脂類合成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。PI13K/Akt是mTORC1激活的重要途徑，Akt及其在Thr308位點(diǎn)的磷酸化是PI13K/Akt通路的重要激活位點(diǎn)[10]。研究表明：mTORC1通過磷酸化核糖體S6激酶(S6K1，p70S6K)，或真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，調(diào)控蛋白質(zhì)的合成[11]。

在CD4+T細(xì)胞中，mTORC1可以增加Th17淋巴細(xì)胞亞群分化，抑制mTORC1可以增加Treg細(xì)胞的分化[12]，在Rheb或Raptor基因刪除導(dǎo)致的mTORC1缺失中，Th17淋巴細(xì)胞亞群的分化也受到損害[13,14]。mTORC1主要通過以下幾種方式調(diào)節(jié)Th17淋巴細(xì)胞亞群：1)mTORC1激活下游的HIF-1α，HIF-1α可以通過增加Rorc和Th17淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)的基因表達(dá)，增加快速T細(xì)胞擴(kuò)增所需要的糖酵解活性從而調(diào)節(jié)Th17淋巴細(xì)胞亞群的分化[15-17]；2)mTOR通過磷酸化STAT從而調(diào)節(jié)Th17淋巴細(xì)胞亞群分化[14]；3)mTORC1抑制劑通過減少RORγt的核易位和增加Gfi1表達(dá)來抑制Th17淋巴細(xì)胞亞群分化[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR及Western blot 檢測(cè)各組小鼠腎臟mTORC1信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟Th17/CD4+T比例。與正常對(duì)照組相比，狼瘡鼠組mTOR、p70S6K、Akt及其磷酸化水平顯著升高，Th17/CD4+T比例升高，提示mTORC1信號(hào)通路在狼瘡鼠體內(nèi)被激活，進(jìn)而促進(jìn)Th17淋巴細(xì)胞亞群分化，在SLE的發(fā)病中起著重要作用。該結(jié)論可能為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。