李肯 戚超 趙夏 于騰波

作者單位：266003 山東，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科

肩袖肌腱損傷 ( rotator cuff tears，RCT ) 是造成肩關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙最常見的疾病之一，其中岡上肌腱損傷最為多見[1]，約占肩袖損傷的 35%～38%。肩袖肌腱損傷往往須手術(shù)治療，而手術(shù)成功的關(guān)鍵很大程度上取決于術(shù)后肩袖止點(diǎn)的腱-骨愈合情況，據(jù)統(tǒng)計，肩袖肌腱修復(fù)的失敗率為20%～90%[2]，肩袖止點(diǎn)腱-骨愈合不良不但延長了治療時間，而且還會影響患者術(shù)后肩關(guān)節(jié)的功能康復(fù)[3]。長期以來如何更好地促進(jìn)肩袖腱-骨愈合，使其恢復(fù)原有的功能，一直是運(yùn)動醫(yī)學(xué)科醫(yī)生的追求。辛伐他汀為臨床上常用藥，能夠降低血清膽固醇水平及心臟病的發(fā)作，常用來治療高脂血癥[4-5]。有研究證明局部應(yīng)用辛伐他汀能夠促進(jìn)前交叉韌帶重建骨隧道腱-骨愈合的作用[6]，但其對于肩袖修復(fù)術(shù)后腱-骨愈合的作用，目前研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過建立兔肩袖損傷模型來研究局部應(yīng)用辛伐他汀對肩袖修復(fù)術(shù)后腱-骨愈合的影響。

材料與方法

一、材料和實(shí)驗(yàn)對象

辛伐他汀 ( 杭州默沙東制藥有限公司 )、明膠海綿 ( 南京金陵制藥廠 )、Instron-3300 萬能材料試驗(yàn)機(jī) ( 青島大學(xué)提供 )、24 只體重 2.0～3.0 kg 的成年雄性新西蘭大白兔 ( 青島大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供 )。

二、辛伐他汀 / 明膠海綿復(fù)合物的制備

將 5 mg 辛伐他汀粉末溶于 10 ml 無水乙醇中混合均勻，然后吸取 1 ml 該溶液浸入明膠海綿 ( 10 mm長，5 mm 寬，2 mm 高 ) 中，使每塊明膠海綿含有0.5 mg 的辛伐他汀，自然干燥消毒后置于 4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 a：一片約 0.8 cm × 0.5 cm 的岡上肌( SSPT )；b：將辛伐他汀 / 明膠海綿復(fù)合物( SGS ) 填塞到大結(jié)節(jié)骨槽 ( Bone trough ) 上并用5-0 Prolene 縫線穿過骨孔 ( Bone tunnels ) 以水平褥式縫合法縫合Fig.1 a: A slice of supraspinatus ( SSPT ): 0.8 cm ×0.5 cm approximately; b: The complex of simvastatin /gelatin sponge ( SGS ) was stuffed into the bone trough the large tuberosity of the humerus and the supraspinatus was sutured through the bone tunnels with 5-0 Prolene nesis by horizontal mattress suture

三、 兔肩袖損傷模型的建立

取所有兔的右肩關(guān)節(jié)作為手術(shù)側(cè)，用 3% 的戊巴比妥鈉 ( 1ml / kg ) 行耳緣靜脈緩慢推注，麻醉成功后固定于動物手術(shù)臺，常規(guī)備皮、消毒、鋪無菌巾。沿兔肩胛岡遠(yuǎn)端 2 cm 作縱行切口，鈍性分離三角肌并暴露兔崗上肌，于大結(jié)節(jié)止點(diǎn)銳性切斷岡上肌腱，用刀片沿肱骨大結(jié)節(jié)至岡上肌近端方向剝離約 0.8 cm×0.5 cm 的岡上肌區(qū)域建立兔全層肩袖損傷模型，剝離下的岡上肌 ( 圖 1a )。岡上肌游離端用縫線標(biāo)記以便二次手術(shù)準(zhǔn)確定位。術(shù)后常規(guī)飲食，慶大霉素 ( 3 mg / kg ) 右后腿肌注預(yù)防感染，持續(xù)3 天，術(shù)后單籠限制性飼養(yǎng)，無須制動固定。

四、實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)過程

24 只造模后的兔子隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組 ( n＝12 ) 和對照組 ( n＝12 )。實(shí)驗(yàn)組即辛伐他汀 / 明膠海綿復(fù)合物組，造模后 1 周將右側(cè)大結(jié)節(jié)上殘留的纖維軟骨完全剔除，牙科磨鉆將岡上肌腱-骨結(jié)合部分打磨一骨槽 ( 10 mm 長，5 mm 寬，2 mm 深 )，用直徑為0.8 mm 的克氏針自骨槽內(nèi)側(cè)向大結(jié)節(jié)外側(cè)皮質(zhì)鉆兩個交叉的骨孔，將辛伐他汀 / 明膠海綿復(fù)合物填塞入骨槽內(nèi)，5-0 Prolene 不可吸收縫線以水平褥式縫合法穿過骨孔將岡上肌肌腱斷端拉回骨槽，并在肱骨大結(jié)節(jié)外側(cè)皮質(zhì)打結(jié)固定 ( 圖 1b )。對照組僅填塞入明膠海綿，其余處理同前述。

五、檢測方法

1. 大體觀察：觀察有無傷口感染、免疫反應(yīng)以及 BTJ 愈合情況等。

2. 生物力學(xué)測試：兩組于術(shù)后 2、4、8 周各處死 4 只兔子，以岡上肌止點(diǎn)為中心，截取整個岡上肌及近端肱骨，將標(biāo)本固定在美國 Instron-3300 萬能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行拉斷測試，載荷率為 5 mm /min，測量最大抗拉強(qiáng)度及剛度 ( 圖 2 )。

3. HE 染色觀察：將生物力學(xué)測試完的標(biāo)本置于10% 甲醇溶液中固定后 24 h 行甲酸脫鈣，脫鈣完全后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最終以5 μm 厚度切片行 HE 染色。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間均值比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大體觀察所見

所有兔子術(shù)后均存活，切口愈合良好，未見滲液、感染及辛伐他汀不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組 BTJ 愈合可，可見輕度炎癥反應(yīng)；對照組肩關(guān)節(jié)積液較多，瘢痕粘連較重，部分 BTJ 呈腱-骨分離狀態(tài)。

二、生物力學(xué)檢測

實(shí)驗(yàn)組的最大抗拉強(qiáng)度和剛度在 2、4、8 周逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )；實(shí)驗(yàn)組2 周最大抗拉強(qiáng)度和剛度與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0.05 )；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 4、8 周的最大抗拉強(qiáng)度和剛度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。提示實(shí)驗(yàn)組的力學(xué)性能高于對照組 ( 表 1，2 )。

表1 術(shù)后各時間點(diǎn)最大抗拉強(qiáng)度 ( N )Tab.1 Results of maximum tensile strength at different time points after surgery ( N )

表2 術(shù)后各時間點(diǎn)剛度 ( N / mm )Tab.2 Results of stiffness at different time points after surgery ( N /mm )

三、HE 染色

實(shí)驗(yàn)組 2 周腱-骨界面可見大量新生毛細(xì)血管和較多成纖維細(xì)胞增生，并夾雜大量炎性細(xì)胞浸潤 ( 圖 2 )。對照組 2 周肌腱與骨結(jié)合松散，中間有疏松結(jié)締組織，可見梭形成纖維細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組少 ( 圖 3 )。實(shí)驗(yàn)組 4 周炎性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，可見較多新生毛細(xì)血管和軟骨細(xì)胞增生 ( 圖 4 )。對照組 4 周肌腱與骨結(jié)合較 2 周時致密，梭形成纖維細(xì)胞遍布視野，未見軟骨細(xì)胞( 圖 5 )。實(shí)驗(yàn)組 8 周腱-骨界面已出現(xiàn)典型的四層移行帶結(jié)構(gòu)，層次清楚，可見“潮線”以及密集的Sharpey 纖維 ( 圖 6 )。對照組 8 周肌腱與骨連接較為致密，腱-骨界面可見疏松無序的 Sharpey 纖維( 圖 7 )。

圖2 實(shí)驗(yàn)組 2 周 ( HE × 100 ) Fig.2 2 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

圖3 對照組 2 周 ( HE × 100 ) Fig.3 2 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

圖4 實(shí)驗(yàn)組 4 周 ( HE × 100 ) Fig.4 4 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

圖5 對照組 4 周 ( HE × 100 ) Fig.5 4 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

圖6 實(shí)驗(yàn)組 8 周 ( HE × 100 ) Fig.6 8 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

圖7 對照組 8 周 ( HE × 100 ) Fig.7 8 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

討 論

肩袖對維持肩關(guān)節(jié)的穩(wěn)定和活動起著十分重要的作用。肩袖損傷后由于肌腱攣縮粘連、脂肪浸潤以及術(shù)后腱-骨愈合不良等原因常導(dǎo)致再次撕裂。正常的肩袖止點(diǎn)愈合又稱為直接愈合，是較為理想的腱-骨愈合方式，即腱-骨界面依次由肌腱，未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨組織形成牢固的直接止點(diǎn)。而肩袖修復(fù)術(shù)后肌腱與骨多以纖維瘢痕組織粘連，難以形成直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)固性大大降低。因此，如何促進(jìn)肩袖止點(diǎn)的直接愈合成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)科醫(yī)生研究的熱點(diǎn)。

目前促進(jìn)腱-骨愈合的方法有很多，其中包括間充質(zhì)干細(xì)胞、沖擊波、骨膜移植、富血小板血漿[7-8]。辛伐他汀屬于 HMG-CoA 還原酶抑制劑，是臨床上常用的降脂藥物。有研究表明辛伐他汀能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，來促進(jìn)血管和骨的生成從而刺激骨折愈合[9-10]。同樣，辛伐他汀對腱-骨愈合的積極作用也與血管生成和骨形成增加有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)組 2 周，腱-骨界面可見大量新生毛細(xì)血管生成，證明辛伐他汀能夠增強(qiáng)腱-骨界面的血管再生，從而促進(jìn)腱-骨愈合。而且在腱-骨愈合中，新生血管的生成比骨的生成意義更大，因?yàn)樾律艿纳梢馕吨?骨界面的骨再生[11]。在實(shí)驗(yàn)組 2 周，腱-骨界面可見大量炎性細(xì)胞浸潤，是由于腱-骨愈合的早期需經(jīng)歷炎癥機(jī)化，而辛伐他汀對炎癥因子具有調(diào)節(jié)作用，它可以使炎性細(xì)胞在趨化因子的作用下向腱-骨界面遷移從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，各種炎性細(xì)胞可以釋放大量生長因子來促進(jìn)腱-骨愈合。另外，辛伐他汀也可促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生成。在實(shí)驗(yàn)組4 周，腱-骨界面可見大量軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生，纖維軟骨移行帶逐漸形成，但以未礦化的纖維軟骨為主，未見明顯的“潮線”結(jié)構(gòu)以及 Sharpey纖維，表明腱-骨界面正逐漸形成直接止點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組四周炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明腱-骨愈合進(jìn)程由炎癥機(jī)化期進(jìn)入到軟骨修復(fù)期。到實(shí)驗(yàn)組8 周，腱-骨界面已大致出現(xiàn)典型的四層結(jié)構(gòu)，其間可見“潮線”結(jié)構(gòu)以及 Sharpey 纖維。而對照組在各時間點(diǎn)腱-骨界面結(jié)合松散，新生毛細(xì)血管、炎性細(xì)胞及軟骨細(xì)胞明顯少于實(shí)驗(yàn)組，腱-骨愈合緩慢。在生物力學(xué)方面，實(shí)驗(yàn)組 2 周最大抗拉強(qiáng)度及剛度與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這是由于腱-骨界面在最初 14 天主要以纖維組織瘢痕增生為主，彈性差，脆性高，未形成牢固的纖維軟骨帶，因此在此時期患者容易發(fā)生再次撕裂。有研究表明，腱-骨愈合部位轉(zhuǎn)化生長因子-β1 ( TGF-β1 ) 的表達(dá)在 10 天左右達(dá)到高峰并一直持續(xù)到術(shù)后 3～4 周[12]。筆者猜測，腱-骨界面的瘢痕增生主要與 TGF-β1 的表達(dá)增加有關(guān)。而到術(shù)后第 4 周及第8 周，實(shí)驗(yàn)組的最大抗拉強(qiáng)度及剛度均明顯高于對照組 ( P＜0.05 )，表明此時腱-骨界面的愈合方式已由瘢痕增生逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯佑?，纖維軟骨以及新生骨小梁逐漸向腱-骨界面內(nèi)長入，腱-骨界面的抗拉強(qiáng)度及剛度明顯增加。證明辛伐他汀能夠促進(jìn)腱-骨界面的直接止點(diǎn)的形成，增強(qiáng)其生物力學(xué)強(qiáng)度，促進(jìn)腱-骨愈合。

由于辛伐他汀不能很好地吸收，口服給藥須經(jīng)肝臟的首過消除，到達(dá)體循環(huán)的不足 5%，生物利用率低[13]。超大劑量的全身應(yīng)用辛伐他汀會增加肝衰竭，腎臟疾病，橫紋肌溶解，肌痛等風(fēng)險[14]。本研究采用了以明膠海綿作為載體，將辛伐他汀緩慢持久的遞送到局部組織，避免了藥效的流失。明膠海綿具有無毒性、可降解性、良好的三維結(jié)構(gòu)、生物相容性以及生物安全性，是較為理想的載體材料。臨床上常用來作為可吸收填塞物[15]。辛伐他汀已被證明具有局部和全身抗炎特性，但是不同于全身給藥，局部高劑量輸送辛伐他汀會影響細(xì)胞和組織，并引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。因此，選擇合適的局部用藥劑量十分重要。Wong 等[16]用含有 0.5 mg 辛伐他汀應(yīng)用于兔骨缺損模型，骨修復(fù)效果顯著。也有動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[17]，1 mg 辛伐他汀和硫酸鈣的組合治療大鼠顱蓋骨缺損，成骨作用明顯。Stein 等[18]在大鼠下頜骨骨膜上局部施用不同劑量的辛伐他汀( 0.1，0.5，1.0 和 2.2 mg ) 來促進(jìn)骨骼生長。這項(xiàng)研究證明，0.1 mg 的用藥劑量與另外三種相比，雖然不會明顯引起軟組織炎癥，但也不能顯著刺激骨生長。當(dāng)辛伐他汀劑量從 2.2 mg 減少到 0.5 mg 時，炎癥不但可以降低至臨床上更為接受的水平，而且不會犧牲骨的生長潛力。同樣有研究證明[19]，局部應(yīng)用 0.5 mg 辛伐他汀可以明顯減少臨床炎癥并保持顯著的骨生長。因此，本實(shí)驗(yàn)選用 0.5 mg 的辛伐他汀作為注射劑量，達(dá)到了促進(jìn)腱-骨愈合的效果。

本次實(shí)驗(yàn)將明膠海綿作為載體，將辛伐他汀局部應(yīng)用到建立的兔肩袖損傷模型中，材料安全且價格便宜，具有促進(jìn)肩袖損傷修復(fù)術(shù)后腱-骨愈合的作用。但是本實(shí)驗(yàn)樣本量較少且辛伐他汀劑量單一，在未來的研究中，應(yīng)該在大量動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行劑量遞增研究。