方園 張仕濤 屈建強 張世榮 樊欣鑫 朱莽 羅強 王文濤

(1西安市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710018; 2西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710003)

膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見惡性腫瘤，盡管采用手術(shù)、放療、化療等綜合治療手段，但患者預后均不樂觀。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是表皮生長因子家族成員之一[1]，在包括腦星形細胞瘤在內(nèi)的許多腫瘤組織中都呈現(xiàn)高表達，且和腫瘤分級密切相關(guān)，因此EGFR被作為許多腫瘤治療的重要靶點。富含亮氨酸重復序列免疫球蛋白樣蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain proteins 1, LRIG1)[2]，在正常人體組織中均大量表達，但在多種腫瘤組織中表達低。近來研究發(fā)現(xiàn)[3]，LRIG1基因的表達與膠質(zhì)瘤的病例分級及預后相關(guān)，并顯示在膠質(zhì)瘤細胞系中過表達LRIG1基因可顯著抑制EGFR的表達。作為EGFR基因的抑制基因，LRIG1基因能否在膠質(zhì)瘤細胞的放射治療中起到增敏效應是我們最大關(guān)注點。為此我們用前期已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LRIG1，轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細胞系44細胞(Suzhou human glioma Cells-44, SHG44)并穩(wěn)定表達，后用6兆電子伏(6 mega-electron volts, 6MeV)直線加速器2 Gy劑量的射線照射，檢測轉(zhuǎn)染后SHG44細胞中LRIG1、EGFR基因的表達情況，并檢測膠質(zhì)瘤細胞的細胞活性、侵襲能力變化，探討LRIG1基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞SHG44的放射增敏效應及相應機制。

材料與方法

一、材料

人腦膠質(zhì)細胞瘤SHG44細胞株(西安交通大學醫(yī)學院實驗室提供)；10%小牛血清(杭州四季青生物有限公司)；細胞培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)、LRIG1一抗、EGFR一抗、辣根素羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；真核表達載體pEGFP-C1(購自美國Clontech公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)，DNA 凝膠回收試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程 有限公司)，G4l8、DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，鈷60治療機(法國CGR公司，西安交大醫(yī)學院實驗室提供)。

二、方法

1.應用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)入細胞：應用前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LRIG1及空載質(zhì)粒pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染SHG44細胞，并篩選出穩(wěn)定表達細胞株。按Invitrogen公司的Lipofectamine2000 Reagent說明書，重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取、細胞轉(zhuǎn)染三步驟，完成SHG44細胞轉(zhuǎn)染，后用G418(100 μg/μL)進行篩選。3 w后，挑選存活的細胞繼續(xù)用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在50 mL/L CO2中37 ℃培養(yǎng)。穩(wěn)定表達后將膠質(zhì)瘤細胞分三組：SHG44組、SHG44+pEGFP-C1組、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組。三組細胞分別接受來自6 MeV直線加速器2 Gy劑量的射線照射，檢測各組間SHG44細胞對放射治療的敏感性。

2.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法及免疫組化實驗：照射后應用RT-PCR法，檢測SHG44組、SHG44+ pEGFP-C1組、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組三組中基因LRIG1和EGFR的表達情況，并比較其變化。PCR引物序列：LRIG1：forward：5'-CTACCGTGGTCACC CAGCCAGAAAG-3'，reverse：5'-CTACCGTGGTCC CATCCTT-3'，產(chǎn)物892 bp。EGFR：forward：5'-CACG CAGTTGGGGATTTTG-3'，reverse：5'-TTGGGACAGCTT GGATCAC-3'，產(chǎn)物474 bp。β-actin：forward：5'-AG CAGAGAATGGAAGTCAAA-3'，reverse：5'-ATGCTGCT TACATGTCTCGAT-3'，產(chǎn)物266 bp。并用免疫細胞法驗證照射后三組細胞中LRIG1與EGFR基因蛋白表達情況。LRIG1 蛋白以細胞膜和/或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細胞，結(jié)果判定標準為：無染色細胞或陽性細胞數(shù)<10%為(-)，陽性細胞數(shù)為 10%～25%為(+)，陽性細胞數(shù)為 25%～50%為(++)，陽性細胞數(shù)為>50%為(+++)，以陽性細胞≥10%的病例視為陽性表達；EGFR蛋白以細胞膜和/或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細胞，結(jié)果判定標準為：無染色細胞或陽性細胞數(shù)<10%為(-)，陽性細胞數(shù)為 10%～50%為(+)；陽性細胞數(shù)為51%～75%為(++)；陽性細胞數(shù)>75%為(+++)，以陽性細胞數(shù)≥10% 的病例視為陽性表達。

3.四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法實驗：SHG44組、 SHG44+pEGFP-C1組、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組三組細胞分別培養(yǎng)，制成細胞懸液，以每孔細胞懸液100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，每96孔板上每組重復2孔，37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，待24 h細胞貼壁，給予2 Gy照射；照射后24 h，加入配制好的MTT原液10 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去上清液；每孔加150 μL二甲亞礬(dimethyl sulphoxide, DMSO)，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物；酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長490 nm處的吸光度(optical density, OD)值；根據(jù)OD值計算各組中的存活率[細胞存活率(%)=細胞組OD平均值/對照組OD平均值×l00%]。

4.Transwell細胞侵襲實驗(Transwell invasion)：在SHG44組、SHG44+pEGFP-C1組、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組三組細胞中，取對數(shù)生長期的細胞以2×104/孔加入底部鋪有基底膜Matrige的Transwell小室，向下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。接種后即給予2 Gy照射，繼續(xù)24 h。將膜取出，用棉簽擦除小室側(cè)的細胞，下室面用蘇木素染色，顯微鏡下計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞并熒光顯微鏡下觀察

重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LRIG1轉(zhuǎn)染SHG44細胞，經(jīng)培養(yǎng)穩(wěn)定表達后用熒光顯微鏡觀察目的基因LRIG1在SHG44細胞中的表達情況，見圖1。

二、三組細胞中 LRIG1、EGFR mRNA的表達有明顯差異

將目的基因擴增條帶的灰度值與參照基因β-actin擴增條帶灰度值的比值作為每個目的基因mRNA的半定量指標。結(jié)果顯示SHG44、SHG44+pEGFP-C1組中LRIG1、EGFR基因未見明顯差異(P>0.05)，SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組中LRIG1、EGFR基因較前兩者有明顯差異(P<0.01，表1)。

三、三組細胞中LRIG1、 EGFR蛋白的表達有明顯差異

結(jié)果顯示，將SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組結(jié)果作為對比組，與SHG44、SHG44+pEGFP-C1兩組相比，基因LRIG1、EGFR的蛋白表達情況有明顯差異(P<0.01)，而SHG44、SHG44+pEGFP-C1兩組之間比較，基因LRIG1、EGFR的蛋白表達情況無差異(P>0.05，表2)。

四、重組質(zhì)粒組腫瘤細胞的細胞活性明顯下降

經(jīng)2 Gy射線照射后，用MTT法比較SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+ pEGFP-C1-LRIG1三組細胞的細胞活性。結(jié)果顯示SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組中膠質(zhì)瘤細胞的細胞活性較其它兩組有明顯差異(P<0.01)，且顯著減低；而SHG44、SHG44+pEGFP-C1兩組中膠質(zhì)瘤細胞的細胞活動無差異(P>0.05，圖2)。

五、重組質(zhì)粒組腫瘤細胞的侵襲能力明顯下降

經(jīng)2 Gy射線照射后，Transwell細胞侵襲實驗比較SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三組細胞的侵襲能力。結(jié)果顯示SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組中膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力較其它兩組有明顯差異(P<0.01)，且顯著減低；而SHG44、SHG44+pEGFP-C1兩組中膠質(zhì)瘤細胞的細胞活動無差異(P>0.05，圖3)。

圖1 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-LRIG1轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞SHG44后熒光顯微鏡與普通顯微鏡下觀察對比(×200)

Fig 1 The expression of recombinant plasmid pEGFP-C1-LRIG1 transfecting glioma cells SHG44 by fluorescence microscope and general microscope (×200)

A: Fluorescence microscope; B: General microscope.

圖2 SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三組細胞的細胞活性比較

Fig 2 The comparison of cell activity among SHG44, SHG44+pEGFP-C1, and SHG44+pEGFP-C1-LRIG1 groups

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

圖3 SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三組細胞的細胞侵襲能力比較

Fig 3 The comparison of invasive ability of tumor cells among SHG44, SHG44+pEGFP-C1, and SHG44+pEGFP-C1-LRIG1 groups

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

GroupLRIG1EGFR SHG441.132±0.0812.820±0.343 SHG44+pEGFP-C11.202±0.0912.830±0.122 HG44+pEGFP-C1-LRIG12.351±0.157a0.706±0.124a

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

表2 LRIG1、EGFR在SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三組細胞中的蛋白表達情況 [n(%)]

Tab 2 The protein expression of LRIG1 and EGFR among SHG44, SHG44+pEGFP-C1, and SHG44+pEGFP-C1-LRIG1 groups [n(%)]

GroupLRIG1PositiveFeminineEGFRPositiveFeminine SHG4412(12)8881(81)19 SHG44+pEGFP-C120(20)8079(79)11 SHG44+pEGFP-C1-LRIG191(91)a912(12)a88

aP<0.01,vsSHG44, SHG44+pEGFP-C1.

討 論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計[4]，美國的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤患者中，40%為膠質(zhì)瘤；國內(nèi)資料表明，膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的35.26%～60.96%(平均44.69%)，其中絕大部分為惡性星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤。由于膠質(zhì)瘤多呈浸潤性生長，手術(shù)不可能全切，術(shù)后放療是重要的輔助治療手段。令人失望的是多種膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細胞瘤對放療并不敏感[5]。當前理論認為[6]，放療增敏劑能夠有效增加腫瘤的放療敏感性。膠質(zhì)瘤的放療增敏劑主要是分子靶向放療增敏劑。表皮生長因子受體(EGFR)被認為是最有希望的靶點之一。研究顯示[7-8]在多種腫瘤細胞中，靜止細胞中LRIG1的表達水平很低；但當細胞受到EGF刺激后，LRIG1的表達水平會明顯增高，其胞外段的多亮氨酸重復序列和免疫球蛋白樣區(qū)可特異性的識別EGFR胞外段并與之結(jié)合，胞內(nèi)段通過趨化作用吸引胞質(zhì)內(nèi)E3泛素激酶聚集于其附近(如c-cbl)，E3泛素化激酶通過結(jié)合EGFR并介導泛素化作用降解EGFR蛋白?？梢钥闯?，LRIG1蛋白是細胞受到EGF刺激后所產(chǎn)生的負反饋機制，LRIG1蛋白的缺失可使細胞中EGFR持續(xù)高表達。研究顯示[9]，LRIG1的表達率與膠質(zhì)瘤的惡性級別負相關(guān)(P<0.01)，并且LRIG1可以作為判定膠質(zhì)瘤患者預后的獨立預測指標。

本實驗中SHG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三組細胞經(jīng)同等條件照射后，檢測LRIG1 與EGFR mRNA變化，并用免疫組化檢測LRIG1與 EGFR 蛋白表達變化，結(jié)果顯示SHG44、SHG44+pEGFP-C1組中，LRIG1 mRNA與EGFR mRNA的變化及表達后的蛋白情況均無明顯差異(P>0.05)，而SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組細胞相對于前兩組細胞，LRIG1與EGFR mRNA的變化及表達后的蛋白情況有明顯差異(P<0.01)，再次驗證了LRIG1與EGFR的負向調(diào)節(jié)關(guān)系。

LRIG1作為EGFR的負向調(diào)節(jié)劑，能否在膠質(zhì)瘤放射治療中起到增敏效果，是我們主要關(guān)注點。為此我們?nèi)詫HG44、SHG44+pEGFP-C1、SHG44+pEGFP-C1-LRIG1三組細胞經(jīng)同等條件照射后，用MTT發(fā)檢測照射后細胞活性，用Transwell法檢查照射后細胞的侵襲能力。結(jié)果顯示照射后SHG44+pEGFP-C1-LRIG1組細胞，其細胞活性、侵襲能力均較前兩者明顯下降(P<0.01)，而SHG44、SHG44+pEGFP-C1兩組細胞之間比較，其細胞活性、侵襲能力未見明顯變化(P>0.05)。

綜上所述，在膠質(zhì)瘤細胞SHG44中過表達LRIG1基因可通過下調(diào)EGFR基因表達，抑制SHG44細胞的惡性生物學行為，增加放射治療的敏感性。