朱曉冉，趙楠楠，李德海，符群

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

植物多酚是一種新型的天然抗氧化劑，與植物活性成分抗氧化性顯著相關(guān)[1]，由于其低毒、來源廣泛、無副作用且可有效拮抗體內(nèi)過剩的自由基、維持自由基平衡、抑制氧化損傷等優(yōu)點(diǎn)正受到廣大研究者的青睞。植物多酚廣泛存在于植物的根、皮、葉和果實(shí)中，是植物體內(nèi)復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物、芳香族羥基衍生物的總稱，包括簡(jiǎn)單酚、香豆素類、萘醌類、夾氧雜蒽醌類、異黃酮類、黃酮類、木脂素類、單寧（包括水解單寧和縮合單寧）和酚酸類（苯甲酸類和肉桂酸類）衍生物等13類，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)賦予植物多酚抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老和防治糖尿病、心腦血管疾病等多種生物功能[2~4]。

紅皮云杉（Picea koraiensis）又名虎尾松，高麗云杉，屬松科云杉屬常綠喬木，是我國(guó)分布較廣的樹種之一，主要分布在大興安嶺、小興安嶺、完達(dá)山和長(zhǎng)白山林區(qū)等地區(qū)。研究表明松屬植物含有大量的萜類、多酚類和生物堿等活性成分。目前對(duì)植物多酚提取及抗氧化活性的研究相對(duì)較多，但對(duì)紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)降解穩(wěn)定性及體外抗氧化功能穩(wěn)定性的研究尚未報(bào)道。Ali Liazid等[5]通過四種提取技術(shù)提取松子多酚，發(fā)現(xiàn)多酚抗氧化性和多酚含量有顯著的量效關(guān)系。Yi J等[6]研究發(fā)現(xiàn)松多酚能平衡氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)比例，防止失調(diào)、降低由氧化引起的疾病發(fā)生率。植物多酚的穩(wěn)定性將直接影響它的利用、運(yùn)輸和保存等各個(gè)環(huán)節(jié)，溫度、pH、光、金屬離子和添加劑等因素均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響[7]，因此研究并改善紅皮云杉種鱗多酚在食品加工貯藏過程中的穩(wěn)定性，對(duì)于深入研究其功能特性以及拓寬在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有非常重要的意義。

本試驗(yàn)以紅皮云杉種鱗為原料，分別研究紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)在溫度、光照條件、pH、金屬離子和食品添加劑等不同處理?xiàng)l件下紅皮云杉種鱗中多酚含量及抗氧化穩(wěn)定性的變化，從而推斷影響紅皮云杉活性物質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，旨在充分利用紅皮云杉樹種資源，減少多酚類物質(zhì)在儲(chǔ)藏期間活性成分損失，為有效開發(fā)利用紅皮云杉多酚類物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)白山地區(qū)紅皮云杉種鱗；DPPH，美國(guó) Sigma公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、X-5大孔樹脂、亞硫酸鈉、無水乙醇等其它試劑均為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋DK-S12型，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；JA2003萬分之分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52A，上海亞榮生化儀器廠；RT-6000酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；紫外可見分光光度計(jì)TU-1810PL，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅皮云杉種鱗多酚的提取與純化

取適量紅皮云杉種鱗樣品置于一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，室溫下抽提后，冷凍離心，相同條件下復(fù)提，收集提取液，離心，真空濃縮[8]，將濃縮液用處理后的X-5大孔樹脂純化，上樣量為1/3柱體積，流速為 2倍體積/h，60%乙醇作為洗脫劑，分段收集樣品，乙酸乙酯萃取后凍干于-20 ℃冰箱中備用[9]。

1.3.2 貯藏條件對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

準(zhǔn)確稱取紅皮云杉種鱗多酚凍干粉，乙醇溶解配置成一定濃度的多酚樣液，分別考察光照條件、貯藏溫度、pH值、金屬離子及添加劑對(duì)紅皮云杉種鱗多酚保留率及體外抗氧化功能穩(wěn)定性的影響。

1.3.3 紅皮云杉種鱗多酚含量及保留率的測(cè)定

參照Molan[10]的方法，采用福林-酚法，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，溶液吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0103x+0.0308，R2=0.9995。

式中：C為提取液中多酚濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，mL；M為原料質(zhì)量，g。

式中：X為處理后多酚含量(mg/g)；X0為處理前多酚含量(mg/g)。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考PRIOR[11]的方法，在2 mL樣液中加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液，混勻室溫下避光靜置20 min后，在517 nm處測(cè)定吸光值，DPPH·清除率按下列公式計(jì)算。試驗(yàn)設(shè)3組平行，結(jié)果取平均值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值。

1.3.5 總還原力的測(cè)定

參考You[12]的方法，并作出改動(dòng)。樣液1.00 mL加入2.50 mL 1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃下反應(yīng)20 min，速冷后向溶液加入 2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液，5 min后，加入5 mL去離子水，0.50 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)30 min，在700 nm處測(cè)定吸光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（means±SD）表示，數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0與Origin 8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 貯藏溫度對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

貯藏溫度的高低會(huì)影響活性成分的含量和功能，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了幾種貯藏溫度對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量和抗氧功能影響的試驗(yàn)，結(jié)果如圖1和2所示。

圖1 溫度對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.1 Effect of temperature on the content of polyphenols

由圖1可知，隨著溫度和時(shí)間的增加，總體上紅皮云杉種鱗多酚的保留率逐漸降低，不同溫度對(duì)多酚保留率的影響不同，4 ℃和25 ℃儲(chǔ)存條件下的紅皮云杉種鱗多酚含量損失差異不顯著，當(dāng)貯藏10 h時(shí)，多酚保留率分別為93.08%和87.23%。在70 ℃和100 ℃下儲(chǔ)存的多酚保留率下降顯著，貯藏10 h多酚保留率依次為61.45%和35.28%。紅皮云杉種鱗多酚的不穩(wěn)定性可能是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)含有多個(gè)酚羥基，具有很強(qiáng)的還原性，發(fā)生自身的氧化聚合，多酚類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致保留率降低[13]，而低溫下保存有良好穩(wěn)定性，可能是因?yàn)榈蜏匾种屏硕喾友趸概c花青素褪色酶等酶的活性，減弱了對(duì)多酚的氧化作用，從而有效延緩了氧化、縮合及降解，因此低溫儲(chǔ)存多酚的穩(wěn)定性較好。

圖2 溫度對(duì)紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of temperature on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖2可知，隨著溫度的升高，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基和總還原力均降低，即體外抗氧化性呈減弱趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦邷叵露喾又械膬翰杷靥貏e是酯型兒茶素發(fā)生異構(gòu)化或者氧化分解反應(yīng)[14]，因此應(yīng)將紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)低溫保存[15]。

由圖1、2發(fā)現(xiàn)，4 ℃下10 h紅皮云杉種鱗多酚的保留率是100 ℃的2.64倍，4 ℃下DPPH自由基清除率、總還原力依次為100 ℃的1.99倍、2.21倍，多酚保留率下降倍數(shù)與抗氧化能力下降倍數(shù)接近，這是因?yàn)榧t皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)的抗氧化性與多酚含量顯著相關(guān)，在以后的研究中需要探究紅皮云杉種鱗多酚抗氧化的量效關(guān)系。

2.2 不同光照條件對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

光照會(huì)引起多酚類物質(zhì)的降解，為了探究光照對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化能力的影響，本試驗(yàn)比較了避光、室內(nèi)自然光、直射太陽光、紫外線輻射條件下紅皮云杉種鱗多酚含量和抗氧化功能的變化，試驗(yàn)結(jié)果如圖3和4所示。

圖3 光照對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.3 Effect of light on the content of polyphenols

圖4 光照對(duì)紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of light on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖3可知，避光、室內(nèi)自然光、直射太陽光、紫外線可使紅皮云杉種鱗多酚發(fā)生不同程度的降解。避光下儲(chǔ)存的紅皮云杉種鱗多酚 10 d后的保留率為95.15%，室外直射日光和紫外線輻射儲(chǔ)存的紅皮云杉種鱗多酚10 d的儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)多酚含量變化較大，保留率分別為80.88%和65.95%，這主要因?yàn)楣庹掌茐牧硕喾拥慕Y(jié)構(gòu)，加快了多酚自身氧化聚合的速度，高凝軒等[16]研究發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸多酚在紫外線下會(huì)加速分解，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，所以多酚應(yīng)避光保存。

由圖4可知，紅皮云杉種鱗多酚在4種光照條件下，抗氧化能力不同。室內(nèi)自然光照射下DPPH自由基清除率、總還原能力是避光條件下的 94.23%、88.46%，說明散射光對(duì)紅皮云杉多酚抗氧化能力有影響。在紫外輻射下，紅皮云杉種鱗多酚的DPPH清除率、總還原力是避光條件下的49.88%、41.10%，可能因?yàn)樽贤饩€輻射破壞多酚的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，使多酚類物質(zhì)發(fā)生自身的氧化聚合，特別在長(zhǎng)時(shí)間紫外線照射下，抗氧化能力顯著降低。避光下紅皮云杉種鱗多酚的保留率、DPPH自由基清除率、總還原力依次是紫外線輻射的1.44倍、2.00倍、2.43倍，下降趨勢(shì)的差異性可能是因?yàn)樽贤廨椛淠軌蚱茐募t皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)中的原花青素等物質(zhì)。張衛(wèi)波等[17]研究發(fā)現(xiàn)米糠中原花青素在太陽光下照射15 d后相比避光條件下降34.31%，因此為了避免多酚抗氧化能力的損失，應(yīng)將多酚物質(zhì)避光保存[18]。

2.3 不同pH條件對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及體外抗氧化功能的影響

為研究酸堿性對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化能力的影響，本文選用pH 2、pH 4、pH 6、pH 8、pH 10進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖5和6所示。

圖5 pH對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.5 Effect of pH value on the content of polyphenols

由圖5可知，不同pH條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，紅皮云杉種鱗多酚含量都有不同程度的下降，在 pH 2、pH 4、pH 6條件下，多酚含量變化很小，保留率分別為92.84%、86.51%、76.23%。在pH 8、pH 10條件下，2 h內(nèi)多酚含量下降明顯，2 h后下降趨勢(shì)平緩，溶液出現(xiàn)少量沉淀，紅皮云杉種鱗多酚的保留率依次為58.65%、42.05%。相比堿性條件，紅皮云杉種鱗多酚在酸性條件下降解緩慢這可能是因?yàn)槎喾雍卸鄠€(gè)酚羥基，呈弱酸性，酸性條件下氧化分解慢，堿性條件下多酚類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，且含有的羥基數(shù)目越多，在堿溶液中反應(yīng)越快，越不穩(wěn)定[19]。

圖6 pH對(duì)紅皮云杉種鱗多酚抗氧化的影響Fig.6 Effect of pH value on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖6可知，在pH 2和pH 4條件下，紅皮云杉種鱗多酚總還原力和清除DPPH自由基能力較強(qiáng)，表明在此pH值范圍內(nèi)多酚穩(wěn)定，有顯著的抗氧化活性。在 pH 8和 pH 10條件下，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH能力和總還原力顯著下降，這是因?yàn)閴A性條件破壞多酚結(jié)構(gòu)，氧化生成醌類物質(zhì)[20]。由于多酚含酚羥基，呈弱酸性，因而酸性條件下有利于多酚抗氧化活性穩(wěn)定，但隨著pH的增大，OH-破壞了溶液的弱酸性，多酚氧化分解力度加劇，其穩(wěn)定性越來越差，這與圖5紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性的研究結(jié)果一致，但紅皮云杉種鱗多酚保留率和抗氧化能力下降趨勢(shì)不一致，pH 2下多酚的保留率、DPPH自由基清除率、總還原力依次是pH 10的2.21倍、4.56倍、2.79倍，這可能是因?yàn)閴A性條件下紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)中的原花青素等物質(zhì)降解，導(dǎo)致抗氧化能力下降趨勢(shì)大于多酚的降解趨勢(shì)，因此在以后的研究中可探究貯藏條件對(duì)紅皮云杉種鱗原花青含量及抗氧化功能的影響。

2.4 不同金屬離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及體外抗氧化功能的影響

一些金屬離子與多酚類物質(zhì)會(huì)結(jié)合為絡(luò)合物，產(chǎn)生沉淀，影響多酚結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性。本試驗(yàn)分別測(cè)定幾種常見的金屬離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚降解及抗氧化能力的影響。結(jié)果如圖7、8、9所示。

圖7 金屬離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.7 Effect of metal ions on the content of polyphenols

由圖7可知，添加不同的金屬離子，對(duì)紅皮云杉種鱗多酚降解的影響不同，其中鈉、鉀、鈣離子對(duì)多酚含量影響較小，多酚保留率基本在85%以上。銅、鋅、鐵離子對(duì)多酚含量的影響顯著，且三價(jià)鐵離子使多酚溶液顏色迅速變深，多酚含量損失較大，保留率依次為 30.29%、35.19%、29.86%，這可能是由于加入銅、鋅、鐵三種金屬離子后，加速了溶液中多酚的氧化作用和催化反應(yīng)，使多酚含量下降損失。馬雙雙等[21]研究發(fā)現(xiàn) Fe3+、Fe2+、Al3+、Sn2+、Cu2+、Pb2+這6種離子對(duì)蓮子殼多酚具有顯著的破壞作用。

圖8 金屬離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚總還原力的影響Fig.8 Effect of metal ions on total antioxidant capacity of polyphenols

由圖8可知，添加不同的金屬離子，對(duì)總還原力的影響不同，其中鈉、鉀、鈣離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚總還原力影響作用較小，隨著鈉、鉀、鈣離子質(zhì)量濃度的上升，總還原力無顯著變化；添加鐵、銅、鋅離子顯著影響紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)總還原力，且隨著鐵、銅、鋅離子質(zhì)量濃度的上升，紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)總還原力顯著降低。

這可能是因?yàn)殍F、銅、鋅離子與紅皮云杉種鱗多酚形成絡(luò)合物，而且鐵在d軌道上有空軌道，易于接受帶有孤對(duì)電子的紅皮云杉種鱗多酚，導(dǎo)致紅皮云杉種鱗多酚給質(zhì)子能力和表面疏水性降低，從而導(dǎo)致總還原力的降低[22]。

圖9 金屬離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚DPPH自由基清除能力的影響Fig.9 Effect of metal ions on the DPPH radical scavenging activity of polyphenols

由圖9可知，添加不同的金屬離子，對(duì)紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基的能力影響不同。其中鈉、鉀、鈣離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚DPPH自由基清除能力影響作用較小，而添加銅、鋅、鐵離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚DPPH自由基清除活性影響顯著，且隨著銅、鋅、鐵離子質(zhì)量濃度的上升，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基活性顯著下降，空白對(duì)照紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基的清除率依次是添加5%的銅、鋅、鐵離子的2.59倍、2.75倍、4.10倍，這與吳冬青等的研究結(jié)果一致[23]，綜上所述，在生產(chǎn)加工過程中應(yīng)避免紅皮云杉種鱗多酚與銅、鋅、鐵離子接觸。

2.5 不同濃度的蔗糖溶液對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

本試驗(yàn)研究不同濃度的蔗糖溶液對(duì)紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性及體外抗氧化功能的影響，結(jié)果如圖10、11所示。

圖10 蔗糖對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.10 Effect of sucrose on the content of polyphenols

由圖10可知，不同濃度蔗糖溶液對(duì)紅皮云杉種鱗多酚有不同的影響。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著蔗糖溶液濃度的增加，蔗糖溶液對(duì)紅皮云杉種鱗多酚起保護(hù)作用，這可能是由于高濃度的蔗糖溶液降低水分活度，進(jìn)而降低多酚的分解速率。雷月等[24]的研究結(jié)果也表明適宜濃度的糖溶液能增強(qiáng)多酚的穩(wěn)定性，因此可添加適宜濃度的蔗糖溶液，減少多酚的損失。

圖11 蔗糖對(duì)紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.11 Effect of sucrose on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖11可知，隨著蔗糖溶液濃度的上升，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基能力增強(qiáng)，但紅皮云杉種鱗多酚總還原力在添加不同濃度蔗糖溶液吸光度數(shù)值上升緩慢基本不變，總還原能力無顯著變化，說明紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性的變化對(duì)不同的抗氧化指標(biāo)影響不一致，蔗糖對(duì)于多酚總還原力的影響不明顯[25]。

2.6 不同濃度的苯甲酸鈉溶液對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

本試驗(yàn)研究了在添加不同濃度苯甲酸鈉的條件下0~10 h多酚含量的變化情況及不同濃度苯甲酸鈉溶液對(duì)紅皮云杉種鱗多酚體外抗氧化功能的影響，結(jié)果如圖12、13所示。

圖12 苯甲酸鈉對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.12 Effect of sodium benzoate on the content of polyphenols

由圖12可知，不同濃度苯甲酸鈉溶液對(duì)紅皮云杉多酚穩(wěn)定性的影響不同。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著苯甲酸鈉濃度的增加，苯甲酸鈉試驗(yàn)組的多酚保留率略高于空白組，對(duì)紅皮云杉種鱗多酚起到保護(hù)作用。在苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為 0.1%時(shí)，多酚保留率最大，為95.08%?？赡苁怯捎诒郊姿徕c能夠有效抑制微生物，降低微生物對(duì)多酚的利用率[26]。因此可添加適宜濃度的防腐劑苯甲酸鈉，減少多酚的損失。

圖13 苯甲酸鈉對(duì)紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.13 Effect of sodium benzoate on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖13可知，添加不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)紅皮云杉種鱗多酚總還原能力和DPPH自由基清除能力無顯著影響，這是因?yàn)楸郊姿徕c對(duì)紅皮云杉多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性無顯著影響，這與圖12的貯藏穩(wěn)定性的研究研究結(jié)果一致，汪志慧等[27]研究發(fā)現(xiàn)氯化鈉、蔗糖、葡萄糖等食品原料和苯甲酸鈉、山梨酸鉀等防腐劑對(duì)蓮房原花青素的穩(wěn)定性影響不明顯，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了pH值、光照、溫度、金屬離子及添加劑對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及體外抗氧化功能穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明貯藏條件對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能具有顯著影響，在4 ℃、避光條件、酸性條件下貯藏，紅皮云杉種鱗多酚保留率最高，且總還原能力和清除DPPH·能力最強(qiáng)。此外添加鈉、鉀、鈣離子對(duì)紅皮云杉種鱗多酚含量和抗氧化功能無顯著影響，而銅、鋅、鐵離子能夠顯著降低多酚含量和抗氧化功能。濃度超過30%的蔗糖溶液和0.1%苯甲酸鈉溶液能夠保護(hù)紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)，但是隨著濃度的增加抗氧化功能無顯著差異。本試驗(yàn)為紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)，并為有效開發(fā)利用紅皮云杉多酚類化合物提供科學(xué)借鑒。