朱敬萍，于丁一，胡紅美，梅光明，金 雷，顧蓓喬

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

亞硝酸鹽氮是海水中浮游生物和藻類生長、繁殖必不可少的營養(yǎng)元素之一，尤其是在沿海地區(qū)，大量未經(jīng)處理過的工業(yè)廢水以及生活污水，直接通過河流排入湖泊、海洋，這些物質(zhì)富含氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，容易造成水體的富營養(yǎng)化[1-2]。隨著水體中氮、磷的富集，藻類及其它浮游生物會(huì)快速繁殖，引發(fā)赤潮對(duì)海洋生態(tài)安全造成威脅，同時(shí)受污染的水體會(huì)使魚類或其它生物大量死亡。在海水養(yǎng)殖中，當(dāng)亞硝酸鹽含量小于0.1 mg/L時(shí)，一般不會(huì)對(duì)魚類產(chǎn)生明顯損害[3-4]；當(dāng)亞硝酸鹽含量為0.1～0.5 mg/L，會(huì)呈現(xiàn)明顯中毒癥狀；而當(dāng)亞硝酸鹽的含量大于0.5 mg/L時(shí)，中毒癥狀則會(huì)明顯加劇，魚類的某些器官會(huì)出現(xiàn)衰竭現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡[5-7]。人體如果長期攝入過量的亞硝酸鹽可引起急性中毒[8-9]，血紅蛋白變性和癌變[10]等癥狀，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定人體每天最多攝入亞硝酸鉀或亞硝酸鹽的量為0.2 mg/kg。

目前亞硝酸鹽檢測方法眾多，主要采用離子色譜法、極譜法、催化動(dòng)力學(xué)法、熒光法、可見分光光度法、流動(dòng)注射法等[11-16]，近年來，水體中亞硝酸鹽的連續(xù)流動(dòng)注射分析法發(fā)展迅速[17-18]，但采用該法進(jìn)行水產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量測定報(bào)道很少。該方法使用的儀器設(shè)備簡單，試劑消耗少，操作簡單，自動(dòng)化程度高，頻率高（50個(gè)/h），對(duì)實(shí)際樣品分析效果好。食品分析以GB 5009.33-2010分光光度法為主，本文采用紫外可見分光光度法與流動(dòng)注射法進(jìn)行水產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量測定，并進(jìn)行方法比較，對(duì)浙江海域、養(yǎng)殖區(qū)及養(yǎng)殖場采集的樣品進(jìn)行初級(jí)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢測分析，以期了解和掌握浙江海域和養(yǎng)殖區(qū)初級(jí)水產(chǎn)品質(zhì)量安全的狀況。

1 材料與方法

1.1 方法原理

在酸性條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酰胺反應(yīng)，生成偶氮化合物，再與萘乙二胺鹽酸（NEDD）反應(yīng)生成紫紅色化合物，并在550 nm波長下檢測。

1.2 主要儀器與試劑

德國SEAL Analytical AA3流動(dòng)注射分析儀；LED光度計(jì)。TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超聲波（寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司）；實(shí)驗(yàn)室其它常用儀器及器皿。

100 mg/L-N亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：購自中國計(jì)量科學(xué)研究院，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。使用時(shí)，配制成5.0 mg/L-N亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液。

顯色劑：配制時(shí)，700 mL去離子水中加入100 mL磷酸，加入10.0 g磺胺，待完全溶解后，再加入0.50 g鹽酸萘乙二胺（NEDD）和4 mL Brij-35，30%溶液（活性劑），最后用去離子水稀釋至1000 mL，混勻。試劑無色，儲(chǔ)存于棕色瓶中，冷藏。測定前所有試劑均需超聲脫氣。

飽和硼砂溶液（50 g/L）：稱取5.0 g硼酸鈉，溶于100 mL熱水中，冷卻后備用。

亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用去離子水溶解，并稀釋至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（220 g/L）：稱取220.0 g乙酸鋅，加入30 mL冰醋酸溶解，用去離子水稀釋至1 000 mL。

所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（18.2 MΩ·cm）。

1.3 儀器測定條件

啟動(dòng)AA3流動(dòng)注射分析儀軟件，設(shè)定實(shí)驗(yàn)參數(shù)：選擇通道、杯續(xù)杯數(shù)、樣品數(shù)；進(jìn)樣/沖洗：1.5；平滑：16；基線校正：自動(dòng)基線參比10%，運(yùn)行延遲時(shí)間6.0 min。設(shè)置進(jìn)樣速率為60個(gè)/h。泵入去離子水至基線穩(wěn)定后，插上加熱池（37℃）電源，再泵入試劑到進(jìn)樣通道，達(dá)到試劑基線穩(wěn)定；測定樣品前，先測標(biāo)準(zhǔn)曲線中標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的最高點(diǎn)，在最佳峰高75%～95%之間，設(shè)定它的增益點(diǎn)。然后開始自動(dòng)分析。啟動(dòng)工作程序,儀器自動(dòng)取樣并進(jìn)行分析檢測，分析全部完成后電腦自動(dòng)輸出各樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度值。亞硝酸鹽流動(dòng)注射分析模塊如圖1。

1.4 樣品采集與預(yù)處理

圖1 亞硝酸鹽流動(dòng)注射分析模塊流路圖Fig.1 Flow injection analysis module flow chart of nitrite

于2015年8月至12月分別在浙江海域和樂清灣養(yǎng)殖區(qū)及養(yǎng)殖場，共采集了25個(gè)品種共計(jì)170個(gè)樣品，進(jìn)行初級(jí)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測。其中，海水魚：鱸魚、黒鯛、小黃魚、帶魚、馬鮫魚、龍頭魚、鯧魚和鰳魚；淡水魚：鯽魚、白鰱、白鯧、鳊魚、鯉魚和鳙魚；蝦蟹類：南美白對(duì)蝦、白蝦、紅蝦、梭子蟹、青蟹和中華沙蟹；貝類：泥蚶、毛蚶、縊蟶、青蛤和文蛤。采集的鮮活樣品冰凍保鮮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，然后對(duì)不同種類的樣品進(jìn)行下一步的處理。取樣品肌肉可食部分，用高速粉碎機(jī)勻漿，放入-20℃冷庫保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品的預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取5.00 g左右試樣，置于50 mL燒杯中，加入12.5 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，使用300 mL 70℃的熱水將試樣洗入500 mL容量瓶中，然后在沸水浴中加熱15 min，并不時(shí)振搖，取出在冷水浴中冷卻至室溫。

提取液凈化：將上述提取液，邊振蕩邊加入5.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5.0 mL乙酸鋅溶液，使蛋白質(zhì)沉淀。加水至刻度，搖勻，靜置30 min后，除去上層脂肪，取上清液，過濾，并將初濾液30 mL棄去，然后將濾液備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

在反應(yīng)條件下，樣品和試劑的流速會(huì)產(chǎn)生變化，同時(shí)通過流速中的反應(yīng)溫度也會(huì)有變化。本實(shí)驗(yàn)首先研究了試劑及載流流速對(duì)信號(hào)的影響。結(jié)果表明，在流速0.20～2.00 mL/min范圍內(nèi)，隨著速度加快，峰高先逐漸增大，達(dá)到一定程度后峰高重現(xiàn)性變差，經(jīng)過反復(fù)測試，當(dāng)試劑流速為0.80 mL/min，載流流速為1.20 mL/min時(shí)，信號(hào)響應(yīng)最高，呈穩(wěn)定狀態(tài)，因而設(shè)置為最佳流速。當(dāng)選擇進(jìn)樣體積在0.2～1.2 mL時(shí)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣體積太小或太大，都會(huì)引起反應(yīng)不完全或帶過，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；經(jīng)過反復(fù)測試表明，信號(hào)響應(yīng)值隨進(jìn)樣體積增大而緩慢增加；為保證檢測頻率，本研究最終選擇進(jìn)樣體積為0.5 mL，反應(yīng)溫度為37℃為最佳。

2.2 顯色劑優(yōu)化

顯色劑中磺胺用量對(duì)光電壓產(chǎn)生較大的影響，在1 L顯色劑中分別加入磺胺的量為：2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、12.0 g、14.0 g，結(jié)果表明，隨著磺胺用量的增加，吸光度值先增大后減小，當(dāng)加入磺胺10.0 g時(shí)，吸光度值達(dá)到最大。因此，最終選用磺胺質(zhì)量為10.0 g。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限

用5.0 mg/L-N亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液，設(shè)定檢測范圍0.00～0.250 mg/L和檢測范圍0.0～0.150 mg/L，分別繪制分光光度法和流動(dòng)注射法標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：兩種方法在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有呈良好的線性關(guān)系。

空白鱸魚樣品通過添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后經(jīng)前處理，分別用AA3流動(dòng)注射分析儀和分光光度法檢測分析，方法檢出限（LOD）為信噪比S/N=3的樣品濃度，計(jì)算得出AA3流動(dòng)注射分析儀和分光光度法檢測亞硝酸鹽的LOD分別為0.81和1.00 mg/kg，方法回收率均大于80%，由此可見本研究建立的連續(xù)流動(dòng)注射法與國標(biāo)分光光度法，結(jié)果保持一致，能滿足實(shí)際樣品分析要求。方法線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表1。

表1 連續(xù)流動(dòng)注射法和分光光度法的線性回歸方程，檢出限Tab.1 Linear regression equation,limits of detection(S/N=3)of continuous flow injection analysis and spectrophotometry

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

通過優(yōu)化好的測量條件，經(jīng)AA3流動(dòng)注射分析儀，在空白小黃魚、青蛤和南美白對(duì)蝦樣品中，分別加入低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和RSD，考察方法準(zhǔn)確度和精密度。（表2）表明，3個(gè)不同加標(biāo)水平下，亞硝酸鹽平均回收率為81.8%～97.6%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差4.98%～10.8%之間，結(jié)果表明該方法回收率較高、精密度較好，能滿足不同水產(chǎn)品中亞硝酸鹽檢測要求。測定結(jié)果見表2。

表2 不同加標(biāo)水平下的回收率和精密度（n=6）Ta.2 Results of recovery and precision of different spiked samples(n=6)

2.5 實(shí)際樣品及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

本文對(duì)浙江海域和樂清養(yǎng)殖區(qū)及養(yǎng)殖場采集的樣品，對(duì)不同種類的樣品進(jìn)行前處理，取其肌肉可食部分5 g左右進(jìn)行提取，將提取液凈化后進(jìn)行分析，用流動(dòng)注射法平行測定3次，結(jié)果均為未檢出，并采用國標(biāo)法分光光度法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果保持一致，也均為未檢出。同時(shí)對(duì)建立的流動(dòng)注射法采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）分析結(jié)果見表3。

表3 實(shí)際樣品測定結(jié)果（n=6）Tab.3 Analytical results of the samples(n=6)

由表3可知，AA3流動(dòng)注射分析儀測定樣品的加標(biāo)回收率為81.0%～105.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.48%～6.56%，準(zhǔn)確度較好。結(jié)果表明，該方法有較好的精密度，線性范圍較寬，回收率、檢出限滿足分析方法要求。

3 小結(jié)

本研究建立了水產(chǎn)品中亞硝酸鹽連續(xù)流動(dòng)注射分析法，優(yōu)化了樣品前處理和分析測試條件，最佳條件下。標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.0～0.250 mg/L濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.81 mg/kg，該方法簡單、快速，自動(dòng)化程度高，基體干擾較小，線性范圍較寬，回收率、檢出限滿足分析方法要求，適用于不同水產(chǎn)品中亞硝酸鹽的監(jiān)控。本研究為科學(xué)制定水產(chǎn)品中亞硝酸鹽測定提供了有力的技術(shù)支撐。