盧瑋筱，陳永霞，祁鵬志

(國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022)

扁玉螺Neverita didyma，屬于軟體動物門Mollusca，腹足綱Gastropoda，玉螺科Naticidae，玉螺屬Neverita，俗稱“香螺”，“肚臍菠蘿”。其主要分布于我國的南北沿海地區(qū)，比如渤海、東海等。扁玉螺具有低脂肪、高蛋白的特性，營養(yǎng)價值較高。食用扁玉螺還會有強身健體、美容養(yǎng)顏的功效[1]。但是隨著過度捕撈和棲息地喪失，扁玉螺的資源量日益減少，保護(hù)扁玉螺資源已經(jīng)成為重要的任務(wù)。所以分析扁玉螺的遺傳變異及其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性規(guī)律，這對于以后扁玉螺的繁殖發(fā)展具有重大意義[2]。目前尚缺乏扁玉螺基因組分析和遺傳多樣性的相關(guān)研究，其分子標(biāo)記分析研究僅見孫史威等[3]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，用13對引物對90個扁玉螺進(jìn)行了PCR擴增，同時研究建立了扁玉螺ISSR-PCR反應(yīng)體系[4]。

簡單序列重復(fù)分子標(biāo)記(Simple sequence repeat,SSR)，也可以稱為微衛(wèi)星(Microsatellite)，其存在于原核生物及其真核生物基因組[5]。它一般以1～6個堿基為重復(fù)單元，KALIA,et al[5]在研究中發(fā)現(xiàn)每50 kb中存在1個SSR。按照來源來分的話，SSR可以分為g-SSR(基因組)和EST-SSR(轉(zhuǎn)錄組SSR)[6]。相對于前者，后者的標(biāo)記方式更為方便，而且省時省力。同時EST-SSR標(biāo)記方法，由于其基因功能和其多態(tài)性相關(guān)性，可以在相近的物種之間達(dá)到一種良好的通用作用[7]。目前發(fā)現(xiàn)，關(guān)于EST序列的SSR標(biāo)記分子大多研究報道的是植物，動物相對較少。呂振明等[8]對曼氏無針烏賊Sepiella japonica作出研究報道。對扁玉螺SSR的應(yīng)用很少，本文研究了扁玉螺轉(zhuǎn)錄組測序得到EST序列，發(fā)現(xiàn)扁玉螺的SSR位點，分析研究扁玉螺SSR位點的特點及其組成，以期為扁玉螺物種的遺傳多樣性及其標(biāo)記分子育種提供理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

扁玉螺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于課題組2017年Illumina高通量深度測序結(jié)果，分析的組織是扁玉螺的肝臟。委托北京諾禾致源科技股份有限公司采用Illumina HiseqTM進(jìn)行RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序利用Trrinity進(jìn)行序列組裝，得到233 858條Unigenes，以此作為分析數(shù)據(jù)。

1.2 扁玉螺EST-SSR的篩選

為檢測扁玉螺的SSR位點，利用MISA軟件[9]對其Unigene序列進(jìn)行分析。SSR位點包含了單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸重復(fù)。判斷的標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)至少10次；雙核苷酸重復(fù)至少6次；三核苷酸重復(fù)至少5次、四核苷酸重復(fù)至少5次、五核苷酸重復(fù)至少5次、六核苷酸重復(fù)至少5次。

1.3 扁玉螺EST-SSR引物設(shè)計

對識別出的SSR序列，采用Primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)是：退火溫度(Tm)為58～60℃，上游引物和下游引物的Tm差值不能大于2℃；引物長度在11～20 bp；GC量在43%～45%。

1.4 扁玉螺EST-SSR引物篩選

結(jié)果中沒有引物的SSR，是因為Primmer 3無法對其設(shè)計出引物來。關(guān)于擴增是否會產(chǎn)生引物二聚體的問題，可從多對引物中挑選出最好的引物進(jìn)行擴增。篩選原則：2個引物之間不發(fā)生互補，特別是引物3＇端，即使無法避免，其3＇端互補堿基也應(yīng)不大于2個堿基。隨機選擇引物，驗證SSR引物是否可用，進(jìn)行PCR擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁玉螺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與統(tǒng)計

通過對扁玉螺的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，共獲得305 060 534條序列，其中中間未知堿基序列的片段N為0.02%，并且每個扁玉螺的Q20%和Q30%均不大于97%，平均每個樣品的GC含量占該樣品總堿基數(shù)的43%～45%，這些數(shù)量和質(zhì)量都比較高，這為下一步的分析組裝奠定基礎(chǔ)。最終被拼裝成N 50為2 131 bp，N 90為558 bp，平均長度為1 304 bp的233 858條Unigenes，具體序列長度分布(表1)并且我們可以發(fā)現(xiàn)序列長度與長度范圍成反比，這可以證明扁玉螺測序及組裝效果頗好，這為接下來的功能研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

表1 扁玉螺Unigene數(shù)據(jù)組裝結(jié)果Tab.1 Results of assembled Unigene for N.didyma

2.2 扁玉螺轉(zhuǎn)錄組的位點數(shù)量與分布

利用MISA工具搜索扁玉螺轉(zhuǎn)錄組的233 853條Unigene中找到202 337個符合條件的SSRs,發(fā)生頻率(含SSR的Unigene數(shù)與總Unigene數(shù)之比)為45.34%。55 225條Unigene含有單個SSR位點，50 813條Unigene含有復(fù)合SSRs。SSR位點的出現(xiàn)頻率(SSR數(shù)目與總Unigene的數(shù)目比值)為：86.53%。平均每10 kb有1.91個SSR位點，見表2。

表2 扁玉螺轉(zhuǎn)錄組中的SSR搜索結(jié)果Tab.2 Searching results of SSR in transcriptome of N.didyma

扁玉螺EST-SSR類型豐富，從表3可以發(fā)現(xiàn)，單核苷酸到三核苷酸重復(fù)最多，占總SSR位點數(shù)量的99.1%，其中單核苷酸重復(fù)率最高，占到63.44%；其次為雙核苷酸和三核苷酸，分別為24.12%和6.73%。四、五、六核苷酸重復(fù)率總計0.9%，數(shù)量很少，見表3。

2.3 扁玉螺重復(fù)基元的特性

以單核苷酸重復(fù)基元A/T最多，占總SSR的54.15%；其次為雙核苷酸AC/GT和單核苷酸C/G最多，分別為15.90%和9.3%；單核苷酸重復(fù)基元最多，共占63.45%。二核苷酸重復(fù)基元中以AC/GT、AG/CT、AT/AT為多，共占27.69%，CG/CG所占SSR比例非常少，僅有0.20%。在三核苷酸重復(fù)基元中，AAC/GTT、ACC/GGT、AGC/CTG所占比例多，分別為2.05%、1.81%、1%。其他四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元類型較多，數(shù)量非常少，出現(xiàn)頻率很低，見表4。

表3 EST-SSR不同重復(fù)基元分布情況Tab.3 Distribution of different repeat motifs in N.didyma

表4 扁玉螺EST-SSR重復(fù)基元的類型Tab.4 EST-SSR repeat motifs in N.didyma

2.4 扁玉螺轉(zhuǎn)錄組中的SSR重復(fù)次數(shù)

長度可以影響SSR的多態(tài)性，并且SSR重復(fù)次數(shù)可以決定重復(fù)片段的長度。扁玉螺SSR的堿基重復(fù)次數(shù)非常廣泛，整體波動在5～85次，多集中于5～30次。單核苷酸重復(fù)10～98次；雙核苷酸重復(fù)6～36次；三核苷酸重復(fù)5～21次；四核苷酸重復(fù)6～21次；五核苷酸重復(fù)6～17次；六核苷酸重復(fù)6～12次。重復(fù)10次的頻率最高，總共有43 049個，占總SSR總數(shù)的21.27%，其次是重復(fù)6次(12.84%)、11次(12.81%)、12次(8.7%)、7次(6.22%)，30次以上共占7.46%。總體上可以看出，扁玉螺轉(zhuǎn)錄組SSR的重復(fù)次數(shù)以5～10次最多，占總SSR總數(shù)的50.76%，11～20次次之，為40.53%；重復(fù)次數(shù)21～30次為4.45%；重復(fù)次數(shù)大于30的為4.26%。

雖然SSR在基因組上的位置不相同，但是由于其兩端的序列大多是保守的單拷貝序列，所以可以依據(jù)SSR兩端的互補序列設(shè)計出引物，并且通過PCR反應(yīng)體系擴增出含有SSR位點的片段。因為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)次數(shù)不同，所以采用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，并且對其進(jìn)行凝膠電泳，即可顯示SSR位點的長度多態(tài)性。我們采用Primer 3進(jìn)行SSR引物設(shè)計，并針對預(yù)測到的每一個SSR位點分別設(shè)計了部分引物，見表5。

表5 PCR篩選引物Tab.5 Filtering primers with PCR

3 討論

近些年以來，高通量技術(shù)不斷發(fā)展，測序的成本也非常低。其測序的數(shù)據(jù)也包含了特定的時期和組織的轉(zhuǎn)錄本，特別是基因組信息特別缺乏的物種，因此轉(zhuǎn)錄組學(xué)越來越受到重視[10]。因其SSR分子標(biāo)記含有豐富的多態(tài)性和等位差異，植物的遺傳多樣性多用此標(biāo)記方式[11-12]，但是動物研究相對較少。

本文以扁玉螺轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行了扁玉螺EST-SSR的研究開發(fā)，結(jié)果顯示表明扁玉螺轉(zhuǎn)錄組中含有豐富的SSR位點從扁玉螺轉(zhuǎn)錄組中共搜索出202 337個SSR，分布于233 858條Unigenes上。SSR的出現(xiàn)頻率為86.52%。物種的不同，SSR的搜索標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫的完整性都會影響SSR的出現(xiàn)頻率[13]。由于SSR標(biāo)記技術(shù)，多用于植物，大多數(shù)的植物EST-SSR以二核苷酸和三核苷酸為主。扁玉螺SSR重復(fù)基元以單核苷酸最多，占到63.44%，其次為雙核苷酸和三核苷酸，分別為24.12%和6.73%。這與曼氏無針烏賊Sepiella maindroni[8]略微有所不同，單核苷酸(38.69%)、三核苷酸(31.14%)、二核苷酸(26.35%)，同時本研究也發(fā)現(xiàn)扁玉螺轉(zhuǎn)錄組中，SSR位點最多的是單核苷酸的重復(fù)基元A/T最多，占總SSR的54.15%；其次為雙核苷酸的AC/GT，為 15.9%。

整體來說，扁玉螺轉(zhuǎn)錄組的SSR類型豐富，出現(xiàn)頻率很高，這些SSR在提高多態(tài)性潛能方面發(fā)揮著重要的作用。結(jié)果表明為更好的研發(fā)新的扁玉螺功能基因SSR分子標(biāo)記提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。這對于開展扁玉螺種質(zhì)資源研究和未來分子育種具有重要作用。