沈志方，許學升，孫繼蘭

在我國，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CHD）尤其是急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，甚至呈逐年上升趨勢[1]。大量研究表明，心肌和細胞外基質因適應不良變化而致心室病理性重構是心肌梗死進展的重要病理過程[2]。在心室重構的過程中往往會積累較多的促炎因子和血管活性因子，促使心臟成纖維細胞（CFs）的增殖和活化，從而導致心肌過度纖維化[3]。因此抑制CFs活化和心室重構，減輕心肌纖維化的發(fā)生具有十分重要的臨床意義。近些年，微小核糖核酸（miRNAs）在心血管疾病診斷和治療領域表現(xiàn)出巨大的潛力，參與機體多種生理病理調控過程，包括動脈粥樣硬化板塊的形成、心肌梗死后血管再生、心室重構等[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b在靜止期成纖維細胞中表達上調，抑制成纖維細胞的增殖[6]。目前關于miR-125b對心肌梗死后成纖維細胞的生物學行為具體的調控作用及可能的作用機制探討尚少。本研究通過采用脂質體轉染的方法上調/下調成人心臟成纖維細胞（HCF-a）中miR-125b的表達水平，探討miR-125b對HCF-a膠原合成的影響以及可能的作用機制，為冠心病患者提供新的治療選擇。

1 材料與方法

1.1 細胞來源成人HCF-a細胞購自American Type Culture Collection公司。

1.2 主要試劑miR-125b模擬物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自中國博士德生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、細胞凋亡試劑盒，購自美國OMEGA生物公司；抗體，購自美國Abcam公司。脂質體Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)基、心臟成纖維細胞培養(yǎng)基，購自美國Invitrogen公司；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基，購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA細胞消化液（0.25%），購自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；FBS胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗，購自美國ThermoFisher公司。Trizol，購自美國Invitrogen公司；DEPC，購自美國Sigma公司；30%H2O2，購自上海碧云天生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯仿、異丙醇、無水乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水，購自安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司。

1.3 主要儀器GTR16-2型高速臺式冷凍離心機，購自北京時代北利離心機有限公司；實時定量PCR儀，購自美國MJ Research公司；UV-8000紫外分光光度計，購自上海精密儀器儀表公司；多功能酶標儀，購自日本Bio-Rad公司；CX41倒置光學顯微鏡和OLS4100激光共聚焦顯微鏡，購自日本奧林巴斯醫(yī)療公司；電子分析天平，購自上海玉研科學儀器有限公司；Amersham電泳儀，購自瑞典Bioscience公司；恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉移電泳槽，購自北京六一儀器廠；FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)將HCF-a細胞培養(yǎng)在含有10%FBS的成纖維細胞培養(yǎng)基中，將細胞置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代一次。

1.4.2 細胞轉染提前1 d在相應備行轉染的6孔板上接種5×108個細胞，培養(yǎng)24～48 h后，融合率達到50%～60%，在不同2 ml無菌EP管中分別加入適量生理鹽水，然后按照脂質體轉染說明書，在EP管中分別加入5 μl miR-125 b模擬物和250 μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，混勻，室溫放置10 min；另外在5 ul脂質體Lipofectamine 2000溶液中加入250 μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)液，振蕩混勻后，室溫放置10 min；將上述兩種溶液吹打混勻，室溫放置30 min；將脂質體-質粒DNA復合液滴加至孔板細胞表面，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。提取細胞RNA及蛋白，驗證目的基因表達情況及轉染效率。

1.4.3 實驗分組分為空白對照組和miR-125b模擬物轉染組。

1.4.4 MTT法檢測細胞增殖活性將HCF-a細胞（2×105個/孔）單層接種到96孔板中，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組設置8個平行孔，每隔24 h選擇6個重復孔加入20 μl MTT，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl DMSO，置于振動器上震動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結晶物。將96孔板放置于450酶標儀上，檢測波長為570 nm，參比波長為450 nm處的吸光光度值（OD值），計算平均值。

1.4.5 遷徙與侵襲實驗采用胰蛋白酶消化細胞，將細胞置入離心管中，離心，棄上清；加入無血清的DMEM重懸；調整細胞濃度為3×103個/ml。將100 μl HCF-a細胞（5×104個/孔）單層接種到24孔板中由聚碳酸酯膜嵌套的transwell小室中，外部小室中放入600 μl含有10%FBS的成纖維細胞培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育12 h；將侵襲小室內部用4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS進行清洗；然后用0.1%的結晶紫將外部小室進行染色30 min，顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數(shù)，計算遷移率。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率收集細胞調整至1×106/ml，采用PBS清洗細胞兩次，加入500 μl binding buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 ul碘化丙啶，混勻，避光孵育15 min，上機檢測。

1.4.7 提取總RNA①收集細胞1×1010個，置于EP管中；②加入1 ml預冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；③加入200 μl氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；④12 000 rpm離心，取上清；⑤加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；⑥12 000 rpm離心，棄上清；⑦加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 rpm離心，棄上清；⑧將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；⑨加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用分光光度計檢測RNA濃度。

1.4.8 RNA逆轉錄根據(jù)試劑盒說明書操作進行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.9 實時定量PCR將20 μl反應體系置于37℃恒溫水浴60 min，85℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應孔取2 μl進行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應體系，95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)45次。引物序列如下： Col-Ⅰ（上游引物：5’-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3’；下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’）；Col-Ⅲ（上游引物：5’-CAGCTTTGAG GTTCGTGTTTGT-3’；下游引物：5’-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA -3’）；α-S M A（上游引物：5’-C A G C T T T G A G G T T C G T G T T T G T-3’；下游引物：5’- A T G C T C T T C T T T T T T G C G G A A A-3’）； TGF-β1（上游引物：5’-GTG TGGAGCAACATCTGGCCTCTA-3’；下游引物：5’- TTGGTTCAGCCACTGCCGAT-3’）；β-actin（上游引物：5’-TGGC GATGGCAGTGTCTTAG-3’；下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’）。

1.4.10 Western blot①提取蛋白樣品；②蛋白樣品凝膠電泳；③轉膜；④封閉；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦顯影；⑧采用化學發(fā)光法檢測膜上的蛋白表達條帶，采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)進行定量分析，以積分光密度（IOD）表示灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用單因素方差分析進行多組間比較，兩組間比較采用t檢驗；數(shù)據(jù)非正態(tài)采用秩和檢驗進行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測miR-125b對HCF-a細胞增殖活性的影響經(jīng)MTT檢測結果顯示，隨著細胞生長時間的延長，miR-125b模擬物轉染細胞系生長速度明顯高于空白對照組，尤其是96 h之后，兩組細胞的OD值逐漸出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表1，圖1）。

表1 不同檢測時間點miR-125b對HCF-a細胞增殖活性的影響

圖1 不同檢測時間點miR-125b對HCF-a細胞增殖活性的影響

2.2 miR-125b對HCF-a細胞膠原合成能力的影響經(jīng)PCR和western blot檢測結果顯示，與空白對照組比較，miR-125b過表達對HCF-a細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白水平均有明顯上調作用，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表2，圖2）。

2.3 miR-125b對HCF-a細胞活化能力的影響α-SMA是肌成纖維細胞活化的重要標志物。經(jīng)PCR和western blot檢測結果顯示，與空白對照組比較，miR-125b過表達對HCF-a細胞α-SMA mRNA和蛋白水平均有明顯上調作用，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表3，圖2）。

2.4 miR-125b對HCF-a細胞轉移能力的影響與空白對照組相比，過表達miR-125b可明顯提高HCF-a細胞體外遷移能力，有顯著的統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖3）。

2.5 miR-125b對HCF-a細胞凋亡的影響經(jīng)流式細胞術檢測結果顯示，與空白對照組相比，miR-125b過表達可明顯抑制HCF-a細胞的凋亡，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表4）。

2.6 miR-125b對TGF-β1通路的調控作用經(jīng)RT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，miR-125b過表達可明顯促進TGF-β1 mRNA的表達水平（P＜0.05）；經(jīng)western blot檢測結果顯示，與空白對照組比較，miR-125b過表達對HCF-a細胞Smad2/Smad3蛋白磷酸化水平均有明顯上調作用，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表5、圖4～5）。

3 討論

心肌梗死會引發(fā)心肌細胞、成纖維細胞或細胞外基質代償性活化，從而促使大量膠原蛋白分泌，損傷心肌功能，造成心室重構、心肌纖維化等病理進程，最終導致心力衰竭[7]。非梗死區(qū)心肌纖維化是引發(fā)進展性心室重構的關鍵環(huán)節(jié)，因此如何調控心肌細胞成纖維化是防止心力衰竭的重要研究方向[8]。

圖2 miR-125b過表達對HCF-a細胞膠原Ⅰ、膠原Ⅲ和α-SMA mRNA和蛋白表達的影響

表2 miR-125b對HCF-a細胞膠原Ⅰ和膠原Ⅲ合成能力的影響

表3 miR-125b對HCF-a細胞α-SMA mRNA和蛋白表達的影響

圖3 過表達miR-125b對HCF-a細胞遷徙能力的影響

表4 miR-125b對HCF-a細胞凋亡率的影響

表5 miR-125b對HCF-a細胞TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達的影響

圖4 miR-125b過表達對HCF-a細胞TGF-β1 mRNA表達的影響

圖5 miR-125b過表達對HCF-a細胞p-Smad2/Smad3蛋白表達的影響

MicroRNAs作為內源性非編碼小分子RNA，可通過結合靶mRNA的3’端非編碼區(qū)，編碼區(qū)或5’非編碼區(qū)，在轉錄后水平調節(jié)基因的表達，抑制或降解靶mRNA的翻譯，從而參與細胞凋亡、增殖、分化等多種病理生理過程[9]。有研究顯示，miR-125b可以調控CFs細胞的增殖、活化和凋亡，但是可能的作用機制尚不清楚[10]。根據(jù)國內外研究現(xiàn)狀，轉化生長因子β（TGF-β）與成纖維細胞活化密切相關，其中TGF-β1是重要的亞型分子之一，可以通過抑制膠原酶的分泌和細胞外間質成分的降解，促使CFs向肌成纖維細胞轉化[11,12]；miR-125b是否也參與了對TGF-β1的調控是我們研究的目的。本項研究中，選擇穩(wěn)定性良好的人成纖維細胞HCF-a，分離子成年人心房組織，實驗差異較小。CFs屬于合成膠原的非心肌細胞，同時也是分泌細胞外基質的主要細胞，CFs的增殖和轉化是參與心肌纖維化和心室重構的關鍵環(huán)節(jié)[13]。本項研究首先體外將miR-125b模擬物轉染至HCF-a細胞，對比空白對照組和miR-125b過表達組細胞增殖、膠原合成能力、分化、轉移能力和凋亡的影響。結果顯示，miR-125b過表達可促使HCF-a細胞增殖、膠原Ⅰ和Ⅲ的合成、活化相關標志物α-SMA的表達、轉移，另外，miR-125b也參與成纖維細胞的凋亡。Ghosh等研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能與內皮細胞-間質細胞的轉化過程密切相關。其中TGF-β1/Smad通路是參與調控內皮細胞-間質細胞轉化的重要途徑，CFs和肌成纖維細胞是分泌TGF-β1的主要細胞，TGF-β1大量聚集又會反饋性促使CFs轉化為肌成纖維細胞，從而導致心肌纖維化，甚至引發(fā)心力衰竭。Smad2/Smad3是與TGF-β1信號傳遞密切相關的特異性底物蛋白，通過RT-PCR和western blot方法探討miR-125b對TGF-β1基因及TGF-β1通路下游核心調控蛋白Smad2/Smad3磷酸化的影響，結果顯示，過表達miR-125b可明顯上調TGF-β1 mRNA和p-Smad2/Smad3蛋白的表達，從而提示TGF-β1通路可能是miR-125b參與調控成纖維細胞一系列生物學行為的作用靶途徑。但其關鍵的作用靶點或者靶基因仍然需要進一步研究探討。

總之，抑制TGF-β1/Smad通路引起的心肌纖維化，是治療心肌梗死后進展至心力衰竭的關鍵。隨著對mi RNAs研究的深入，越來越多的mi RNAs被發(fā)現(xiàn)參與心臟成纖維細胞的增殖、活化、凋亡等生理病理過程，這將為mi RNAs用于臨床心血管疾病抗心衰治療提供理論基礎。綜上所述，本項研究證實miR-125b可以通過上調TGF-β1 基因和特異性底物蛋白Smad2/Smad3的磷酸化參與促使心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，因此miR-125b可作為心肌纖維化的干預靶點，為后續(xù)心血管疾病的治療提供了新的研究和治療方向。