王全河，翟關(guān)群

隨著人們生活水平的提高，高脂飲食的危害性日益明顯，冠狀動(dòng)脈硬化性心臟?。ü谛牟。珻AD）發(fā)病率也逐年增加[1]，且呈年輕化趨勢(shì)[2]，對(duì)患者、家庭及社會(huì)造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[3]。深入研究冠心病的形成機(jī)制，對(duì)于有效預(yù)防其形成、降低發(fā)病率，具有重要意義。目前高血脂刺激活性氧（ROS）生成增多被認(rèn)為是CAD發(fā)生和發(fā)展的重要原因[4]。過(guò)多的ROS刺激多種炎癥因子表達(dá)升高，如核因子kB（NF-kB）、硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）等，促使動(dòng)脈粥樣硬化形成。研究表明，NLRP3炎癥小體與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切[5]，研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3可在CAD形成中出現(xiàn)異常表達(dá)，推測(cè)NLRP3炎癥小體參與了CAD的發(fā)生及發(fā)展，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究所，所有的動(dòng)物護(hù)理和程序符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)方針，且符合相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。血脂指標(biāo)測(cè)定采用通過(guò)瑞文醫(yī)療生化分析儀（型號(hào)XR420A），NLRP3抗體購(gòu)自博爾西（Bersee），BCA蛋白試劑盒品牌：Solarbio （貨號(hào)：PC0020），RIPA裂解液購(gòu)自Bosterbio（貨號(hào)：AR0105）,bio-Rad Mini V垂直電泳儀和Trans Blot儀（GE公司），PCR儀品牌Thermo Fisher，Trizol試劑，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CAD動(dòng)物模型制備雄性SD大鼠（210～220 g，6周）共160只，飼養(yǎng)于無(wú)菌環(huán)境中，并予以正常飲食及飲水，直至可自由采食1周。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重后并編號(hào)處理，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組（Control組40只）、高脂飲食（A組40只）、高脂飲食+空載體慢病毒組（B組40只）、高脂飲食+NLRP3-miRNA慢病毒組（C組40只）。除Control組單純喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料外，其余三組均為基礎(chǔ)飼料+高脂飲食（高脂飲食為3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油）。同時(shí)除對(duì)照組外其余實(shí)驗(yàn)大鼠每日清晨8:00給予維生素D3（Vitamin D3）300 000 IU/kg肌肉注射并予尼古?。∟icotine）25 mg/kg溶于2 ml花生油中灌胃，晚6:00予尼古丁25 mg/kg溶于花生油中再次灌胃，Control組予生理鹽水肌注和花生油灌胃處理。通過(guò)RNAi干擾技術(shù)構(gòu)建沉默率最高的質(zhì)粒，最終構(gòu)建pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體，實(shí)驗(yàn)第8周B組實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射慢病毒空載體，C組腹腔注射pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體，其余組分別注射等量生理鹽水，共干預(yù)8周，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)16周。

1.2.2 NLRP3炎性小體及蛋白白介素-1β（IL-1β檢測(cè)）分別于正常飼養(yǎng)第1 d、高脂飲食第4周、第8周、第12周及第16周各組分別斷頸法處死大鼠5只，通過(guò)RT-qPCR及Western Blot檢測(cè)大鼠心肌組織中NLRP3炎性小體其作用蛋白IL-1β表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 血清學(xué)檢測(cè)分別于正常飼養(yǎng)第1 d、高脂飲食第4周、第8周、第12周、第16周抽取大鼠股動(dòng)脈血，經(jīng)肝素抗凝及高速離心（2000 r/min）處理后，分離血漿，注入已加好的10% EDTANa2（1.5 mg/ml） 30 μl（乙二胺四乙酸二鈉）及Aprotinin（500 kiu/ml）20 μl（胰蛋白酶抑制液溶液）的EP管中，-80℃凍存?zhèn)溆茫瑫r(shí)測(cè)定總膽固醇（TC）及三酰甘油（TG）。

1.2.4 心肌組織及冠狀動(dòng)脈病理切片各組16周時(shí)處死大鼠5只并獲取冠狀動(dòng)脈5 mm及心臟橫斷面組織，組織離體后用10%的formalin固定，HE染色后觀察冠狀動(dòng)脈壁斑塊沉積和心肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況評(píng)價(jià)造模情況。

1.2.5 心功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于正常飼養(yǎng)第1 d、高脂飲食第4周、第8周、第12周、第16周通過(guò)心臟彩超測(cè)量，包括左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd），左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs），左室舒張末期室間隔厚度（IVSd），左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），左心室舒張期容積（LVEDV）等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)＜5時(shí)，采取Fishe精確概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 NLRP3炎癥小體及蛋白IL-1β的表達(dá)通過(guò)RT-qPCR及Western Blot檢測(cè)心肌組織中NLRP3炎性小體表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在高脂飲食組大鼠的心肌組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平及mRNA水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖1），IL-1β表達(dá)水平及mRNA水平亦明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖2）；通過(guò)RNAi干擾技術(shù)對(duì)NLRP3蛋白表達(dá)進(jìn)行沉默干預(yù)8周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該組大鼠（C組）心肌組織中NLRP3蛋白、IL-1β蛋白表達(dá)水平及mRNA水平較未干預(yù)高脂飲食組（A組及B組）大鼠表達(dá)水平下降（P＜0.05）。

圖1 心肌組織中NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平測(cè)定

圖2 心肌組織中IL-1β蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平測(cè)定

2.2 各組大鼠的血脂變化根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在不同時(shí)間點(diǎn)位，對(duì)4組實(shí)驗(yàn)大鼠血液中的TC及TG進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，分別三組高脂飲食大鼠（A組、B組及C組）與對(duì)照組大鼠相比血漿中的TC和TG水平均顯著升高（P＜0.05）；而進(jìn)行慢病毒干預(yù)處理后C組大鼠在干預(yù)后8周，TC及TG水平較A組下降（表1）。

2.3 大鼠心肌改變情況16周時(shí)處死大鼠，通過(guò)組織切片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組正常飲食的大鼠冠狀動(dòng)脈僅出現(xiàn)少量粥樣硬化斑塊，而在另外三組高脂飲食大鼠中均出現(xiàn)了明顯的粥樣硬化斑塊（圖3A）；高脂飲食實(shí)驗(yàn)的大鼠心肌細(xì)胞切片觀察后發(fā)現(xiàn)，其心肌細(xì)胞明顯腫脹并伴纖維組織增生（圖3B），符合冠心病的心肌病理改變。同時(shí)經(jīng)RNAi干擾技術(shù)沉默處理的大鼠（C組）其冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊程度低于A組；通過(guò)對(duì)大鼠左心室重量稱重并比較左心室重量/體重比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組高脂飲食組大鼠左心室重量/體重比值較對(duì)照組均明顯增加（P＜0.01）；RNAi干擾技術(shù)沉默組大鼠（C組）左心室重量/體重比值較高脂飲食組（A組）降低（P＜0.05） （圖3C）。

圖3 各組大鼠冠脈心肌組織病理切片及左心室/體重比值檢測(cè)結(jié)果

2.4 大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能評(píng)價(jià)通過(guò)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠不同時(shí)間點(diǎn)位的心臟彩超發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組4周后逐漸出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)改變，16周時(shí)，與正常飲食的大鼠相比，高脂飲食大鼠心臟腔室明顯增大，且心臟功能隨高脂飲食的時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)功能下降（P＜0.05），經(jīng)RNAi干擾技術(shù)沉默處理的大鼠中心臟增大的情況較高脂飲食組（A組）降低，而心臟功能有所恢復(fù)（P＜0.05）。

3 討論

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的TC與TG水平檢測(cè)（mmol/L，±s）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的TC與TG水平檢測(cè)（mmol/L，±s）

注：TC：總膽固醇；TG：三酰甘油

組別 control組（n=20） A組（n=20） B組（n=20） C組（n=20）TC TG TC TG TC TG TC TG 1 d 1.50±0.12 0.42±0.16 1.48±0.13 0.31±0.12 1.51±0.15 0.41±0.11 1.47±0.16 0.38±0.14 4 W 1.51±0.13 0.40±0.13 5.35±1.15 0.95±0.14 4.98±1.06 1.01±0.22 5.11±1.06 0.98±0.23 8 W 1.57±0.15 0.44±0.15 13.51±3.21 1.59±0.85 14.78±2.79 1.57±0.55 13.96±2.05 1.39±0.32 12 W 1.52±0.14 0.43±0.12 17.52±2.58 2.25±0.98 18.32±2.37 2.39±1.02 16.30±1.68 1.67±0.85 16 W 1.61±0.18 0.45±0.17 21.75±2.21 3.20±1.05 20.38±1.95 3.37±1.12 18.52±1.63 2.78±1.01

表2 各組大鼠在不同時(shí)段心臟超聲檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠在不同時(shí)段心臟超聲檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：LVIDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVIDs：左室收縮末期內(nèi)徑；IVSd：左室舒張末期室間隔厚度；LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；LVEDV：左室舒張期容積

組別 指標(biāo) 1 d 4周 8周 12周 16周control組 LVIDd（mm） 6.12±0.68 5.78±0.53 6.58±0.85 6.38±0.71 6.75±1.01 LVIDs（mm） 3.21±0.47 3.07±0.36 3.47±0.62 3.52±0.53 3.76±0.71 IVSd（mm） 1.92±0.22 1.85±0.15 2.03±0.37 1.97±0.31 2.32±0.54 LVEF 80.32±8.65 76.68±6.02 83.16±10.08 82.34±9.24 86.59±11.26 LVEDV（mL） 210.89±43.62 206.37±40.43 215.69±49.31 212.32±45.62 220.61±51.75 A組 LVIDd（mm） 6.45±0.82 5.83±0.92 6.21±0.98 7.12±0.71 9.02±0.75 LVIDs（mm） 3.47±0.61 2.75±0.78 1.89±1.34 3.21±0.23 6.31±0.61 IVSd（mm） 1.89±0.11 2.35±0.21 3.21±0.41 2.58±0.15 2.01±0.30 LVEF 79.56±7.86 86.32±6.29 90.85±8.81 80.01±3.21 60.36±2.58 LVEDV（mL） 215.62±45.38 201.21±50.61 160.43±53.21 250.39±60.31 380.56±110.78 B組 LVIDd（mm） 5.95±0.53 6.12±0.98 6.09±0.72 7.42±0.92 8.52±0.51 LVIDs（mm） 3.27±0.51 2.85±0.85 2.01±1.56 3.58±0.46 5.97±0.41 IVSd（mm） 1.81±0.09 2.41±0.32 3.48±0.57 2.46±0.12 1.98±0.18 LVEF 76.25±6.21 87.33±7.21 92.35±9.91 75.32±2.58 63.52±5.37 LVEDV（mL） 209.35±42.22 216.31±56.84 170.85±60.21 240.71±50.32 371.41±90.71 C組 LVIDd（mm） 6.01±0.73 6.14±0.78 6.72±0.84 6.79±0.62 7.01±0.81 LVIDs（mm） 3.51±0.76 3.45±0.97 2.78±1.76 3.21±0.78 4.05±0.81 IVSd（mm） 1.92±0.18 2.51±0.41 3.46±0.53 3.04±0.72 2.71±0.69 LVEF 80.32±8.94 85.28±5.68 94.72±8.91 79.47±7.92 75.21±5.22 LVEDV（mL） 219.85±51.21 220.21±60.21 180±51.23 210.97±53.21 266.78±59.84

CAD已成為導(dǎo)致人類死亡病因中的首位疾病。目前已證實(shí)該疾病與脂質(zhì)代謝異常關(guān)系密切[6]，最終造成心臟形態(tài)及功能改變及不良事件發(fā)生。近年發(fā)現(xiàn)非特異性炎癥與血脂異常關(guān)系密切[7]，深入開(kāi)展非特異性炎癥導(dǎo)致血脂異常進(jìn)而促進(jìn)CAD的研究，對(duì)于有效防控CAD有著重要意義。

NLRP3炎性小體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生[8]，已有研究證實(shí)NLRP3炎癥小體在許多疾病中扮演重要角色，如家族性周期性自身炎癥反應(yīng)、2型糖尿病、慢性肝病、慢性肺部疾病等[9,10]，但遺憾的是NLRP3炎性小體與冠心病相關(guān)報(bào)道少見(jiàn)，具體機(jī)制亦不明確，尚需進(jìn)一步研究。

我們通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)制備大鼠冠心病動(dòng)物模型并對(duì)NLRP3炎性小體表達(dá)水平及其對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常飲食的大鼠相比，高脂飲食大鼠血脂水平顯著升高（P＜0.05）；且冠狀動(dòng)脈均不同程度的出現(xiàn)粥樣硬化斑塊。同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)水平及mRNA水平在高脂飲食組明顯升高，其作用蛋白IL-1β表達(dá)水平及mRNA水平也出現(xiàn)了明顯增高；結(jié)合心臟彩超對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行評(píng)價(jià),我們高脂飲食大鼠心臟形態(tài)明顯增大且心臟功能明顯下降（P＜0.05），為驗(yàn)證是否NLRP3炎性小體表達(dá)水平與心臟結(jié)構(gòu)和功能以及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度相關(guān)，我們通過(guò)RNAi干擾技術(shù)沉默技術(shù)對(duì)高脂飲食大鼠進(jìn)行了處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體表達(dá)水平的下降后，大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊程度有所減輕且心臟結(jié)構(gòu)和功能有所改善，推測(cè)其機(jī)制可能為下調(diào)NLRP3炎癥小體水平從而調(diào)控其作用蛋白IL-1β延緩血管內(nèi)皮損傷，抑制血管內(nèi)皮的非特異性炎癥的發(fā)生[11]，從而改善心臟功能。

綜上所述，冠狀動(dòng)脈硬化型心肌病中NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)水平及mRNA水平明顯升高，與CAD的心臟結(jié)構(gòu)改變、心臟功能及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度相關(guān)，下調(diào)其表達(dá)水平可以改善CAD的心臟改變，改善心臟功能及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度。