張金華，佟愛華，柳 林，徐方江，于鳳泉

慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，又通稱橋本?。℉ashimoto disease，HD），是常見的自身免疫性甲狀腺疾病 （autoimmune thyroid diseases，AITD）之一，其發(fā)生與發(fā)展是環(huán)境因素、自身免疫與遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳因素約占30%左右［1］。ER β基因的5號(hào)內(nèi)含子啟動(dòng)區(qū)域有C和A短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR），其重復(fù)序列的多少與人某些疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)［2］。該研究通過分析ERβ基因（CA）n多態(tài)性在山東漢族女性HD患者中的分布頻率，以期為AITD患者積累更多的遺傳學(xué)資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2015年12月在臨沂市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診及住院的山東漢族女性HD患者資料100例，年齡21～44歲，平均（34.29±7.34）歲。另選擇100例該院同期健康查體漢族女性，年齡 20～46 歲，平均（35.72±6.81）歲，所有入選者均行甲狀腺功能、甲狀腺相關(guān)自身抗體及甲狀腺彩超檢查，均排除甲狀腺疾病；均無自身免疫性疾病及相關(guān)家族史。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 所有HD患者均檢測(cè)甲狀腺功能：游離三碘甲腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）；甲狀腺相關(guān)抗體：甲狀腺過氧化物酶抗體 （TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）和促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）以及甲狀腺彩超檢查。參考2007年柳林［1］等及2007版中國甲狀腺疾病診治指南嚴(yán)格入選與排除。

1.3 ERβ基因檢測(cè)方法

1.3.1 全血DNA抽提 2%EDTA抗凝，靜脈血抽提基因組 DNA（200 μl）（按照上海生工全血基因抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作），溶于60 μl TE中，-20℃儲(chǔ)存。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照2007年既往建立的方法［1］選擇引物。 上游引物：5’AACAAAATGTT GAATGAGTGGGG3’；下游引物：5’GGTAAACCATG GTCTGTACC3’。

1.3.3 PCR反應(yīng)條件與體系 PCR反應(yīng)條件：94℃變性 35 s，60℃退火 35 s，70℃延伸 35 s，30個(gè)循環(huán)后 70 ℃終延伸 10 min。 20 μl反應(yīng)體系：DNA（2 μl），上下游引物（10pmol，各 1 μl），dNTP Mixture（10 mM，0.5 μl），MgCl2（25 mM，1.2 μl），Taq 酶 （5 U/μl，0.25 μl），ddH2O（20 μl）。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 擴(kuò)增產(chǎn)物為ERβ基因CA重復(fù)序列一段長約150～200 bp的基因片段（上海生工測(cè)序分析）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別計(jì)算對(duì)照組和HD患者基因型的頻率?；蛐皖l率和構(gòu)成比比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，以優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%的可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERβ基因CA重復(fù)序列的等位基因在對(duì)照組和病例組分布 分析比較發(fā)現(xiàn)，（CA）n基因型等位基因分布頻率在兩組中不同，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=3.852，P=0.870）。 見表1。

表1 ERβ（CA）n基因型在對(duì)照組和病例組的分布

2.2 CA重復(fù)序列構(gòu)成在比對(duì)照組和病例組中的比較 等位基因型（CA）20在兩組均占最大比例，按照復(fù)次數(shù)n≤20為S型，n＞20為L型的原則，病例組L型構(gòu)成比（37%）小于對(duì)照組（49%）；S型構(gòu)成比（63%）大于對(duì)照組（51%）。兩組構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.938，P=0.087）。 見表2。

表2 對(duì)照組和病例組CA-STR構(gòu)成比比較

3 討論

基因多態(tài)性是指一個(gè)基因位點(diǎn)上存在一種以上的等位基因，其重復(fù)次數(shù)在人群中高度變異，這種變異的串聯(lián)重復(fù)序列決定了DNA長度的高度變異性［3］。ERβ 基因（CA）n重復(fù)序列多態(tài)性，其重復(fù)次數(shù)的不同與人體某些激素水平和一些疾病的發(fā)生有關(guān)。國內(nèi)外有學(xué)者初步研究發(fā)現(xiàn)，ER基因多態(tài)性與某些自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［4］、系統(tǒng)性硬化?。?］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［6］的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。然而Ban［7］研究發(fā)現(xiàn)，ER基因多態(tài)性與AITD無關(guān)。目前，國內(nèi)仍未見類似報(bào)道。

AITD為多基因遺傳病，導(dǎo)致其發(fā)病的易感基因是多個(gè)單核苷酸基因多態(tài)性共同作用的共同結(jié)果。 既往研究發(fā)現(xiàn)，人類白細(xì)胞抗原 II（HLA-II）［8］，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體 22（PTPN22）［9］、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原 4（CTLA-4）［10］，白細(xì)胞分化抗原 40（CD40）［11］，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子 4（STAT4）［12］，以及甲狀腺特異基因［13］均與AITD相關(guān)。然而，國內(nèi)外研究至今未發(fā)現(xiàn)針對(duì)AITD的主效易感基因。

該研究結(jié)果顯示，病例組和對(duì)照組CA重復(fù)序列等位基因型分布頻率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=3.852，P=0.870）；等位基因（CA）20在兩組構(gòu)成比中占比例最大，病例組S基因型構(gòu)成比（63%）大于對(duì)照組 （51%）；L基因型構(gòu)成比 （37%）小于對(duì)照組（49%）。兩組構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.938，P=0.087）。由此提示，HD的發(fā)病與ERβ的CA重復(fù)序列多態(tài)性尚無關(guān)聯(lián)。前期筆者研究發(fā)現(xiàn)［14］，雌激素β受體基因CA重復(fù)序列多態(tài)性與GD的發(fā)病有關(guān)，S基因型個(gè)體易于發(fā)生GD。國內(nèi)尚無此研究，因此該研究結(jié)論的得出在部分上為群體遺傳學(xué)研究積累了部分相關(guān)資料。

綜上所述，AITD的發(fā)生是環(huán)境因素、遺傳因素和免疫因素共同作用的結(jié)果，ERβ基因多態(tài)性與許多自身免疫性疾病存在相關(guān)性。鑒于該研究的局限性，ERβ基因 （CA）n多態(tài)性與HD的遺傳易感性需要擴(kuò)大樣本例和地域人群后更深入研究，從而為AITD的基因遺傳學(xué)積累更多資料。