張春嬌，仲崇明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 連云港222004)

乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種世界性傳染疾病[1]。血液中乙型肝炎病毒DNA（HBV－DNA）可反映患者體內(nèi)病毒活動(dòng)狀況，對(duì)臨床診斷、判斷預(yù)后、指導(dǎo)用藥及治療監(jiān)測(cè)起到了重要作用[2－4]。中國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)[5]?？焖?、簡(jiǎn)便、特異、靈敏的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)對(duì)HBVDNA 檢測(cè)非常重要[6－12]。 目前，檢測(cè) HBV－DNA 方法較多，其中，煮沸法操作步驟繁瑣，快速而性能良好的方法才能較好適應(yīng)臨床需求。核酸免提取方法操作簡(jiǎn)便，本文通過(guò)分析核酸免提取HBVDNA熒光定量PCR法的精密度、準(zhǔn)確度、線性、最低檢測(cè)限，并將結(jié)果與傳統(tǒng)煮沸法進(jìn)行比對(duì)，評(píng)價(jià)該法的檢測(cè)性能。

1 材料與方法

1．1 質(zhì)控血清及標(biāo)準(zhǔn)血清為北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，15例患者血清標(biāo)本來(lái)源于我院診治患者。

1．2 儀器與試劑 ABI－7500熒光定量基因擴(kuò)增儀購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)有限公司，八連管離心機(jī)購(gòu)于蘇州潤(rùn)達(dá)生物技術(shù)有限公司，免提取核酸法試劑及標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于湖南圣湘生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2017013。煮沸法試劑及標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于西安天隆生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20160902。

1．3 方法

1．3．1 HBV－DNA提取與檢測(cè) 煮沸核酸提取法，按照天隆公司HBV－DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。核酸免提取法，按照湖南圣湘生物技術(shù)公司HBV－DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

1．3．2 驗(yàn)證指標(biāo)及驗(yàn)證方法

1．3．2．1 精密度 選用高、中、低三個(gè)濃度陽(yáng)性血清為待測(cè)樣本，各重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算SD、CV。以YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》精密度要求（CV＜5%）為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2．2 準(zhǔn)確度 具有溯源性定值血清 （北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），HBV－DNA含量分別 為 4．6E+06IU/ML，1．41E+03IU/ML 分 別 重 復(fù) 3次檢測(cè)，計(jì)算測(cè)量平均值與認(rèn)定值偏差，以YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》準(zhǔn)確度要求絕對(duì)值偏差不超過(guò)0．5個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量值為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2．3 線性范圍 以煮沸法檢測(cè) 3．71E+8 IU/ML強(qiáng)陽(yáng)性血清作為初始標(biāo)本，依次向下10倍梯度稀釋至 3．71E7 IU/ML、3．71E6 IU/ML、3．71E5 IU/ML、3．71E4 IU/ML、3．71E3 IU/ML、3．71E2 IU/ML、3．71E1 IU/ML，每個(gè)樣本（8 個(gè)）分別測(cè)定 3 次，取對(duì)數(shù)值后計(jì)算均值，將均值與理論值作線性回歸分析（Y為理論值，X為實(shí)測(cè)值），得出線性回歸分析Y=A+BX和相關(guān)系數(shù)R，以YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》線性要求≥0．98為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2．4 最低檢出限 根據(jù) YY/T1182－2010 《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》6．8．2 條款要求，采用乙肝兩對(duì)半全陰血清稀釋康徹斯坦定值質(zhì)控品1．41E+03IU/ML，稀釋47倍，使其達(dá)到湖南圣湘生物技術(shù)有限公司試劑聲明的最低檢出限（30IU/ML），進(jìn)行25次重復(fù)檢測(cè)，以至少22次結(jié)果檢測(cè)出數(shù)值為最低檢出限通過(guò)。

1．3．2．5 將2017年8月13日我院基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室接收的15份血清嚴(yán)格按照煮沸法和免提取法說(shuō)明書(shū)操作。比較兩種結(jié)果一致性，并將陽(yáng)性結(jié)果取對(duì)數(shù)值，做相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2．1 精密度 高、中、低3個(gè)濃度的精密度變異系數(shù)均小于5%。該檢測(cè)方法符合YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》精密度變異系數(shù)CV＜5%的要求，也符合廠家要求，見(jiàn)表1。

表1 精密度評(píng)價(jià)

2．2 準(zhǔn)確度 示值 4．6E+6IU/ML、1．4E+3IU/ML 定值血清測(cè)量值均值分別為 5．75E+6IU/ML，1．9E+3IU/ML，符合 YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》5．4．2a 檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（或參考品）/國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（或參考品），絕對(duì)值偏差不超過(guò)±0．5個(gè)對(duì)數(shù)值的要求，見(jiàn)表2。

表2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)（示值、允許范圍、測(cè)量值為對(duì)數(shù)值）

2．3 線性 HBV－DNA 在 3．71E1 IU/ML－3．71E8IU/ML 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系 Y=0．987X+0．071，R=0．99，符合 YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》相關(guān)系數(shù)R≥0．98的要求，也滿足試劑盒線性范圍要求，如圖1。

2．4 最低檢出限 示值 30IU/ML（對(duì)數(shù)值為 1．48）的樣本25次檢測(cè)結(jié)果有24次出現(xiàn)定量值，對(duì)數(shù)均值 1．53，與廠家聲明的最低檢出限（30IU/ML）相符合。

2．5 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)，以煮沸法為參照X，以免提取法檢測(cè)結(jié)果為Y，兩方法結(jié)果相關(guān)性分析，Y=0．979X+0．134，R=0．99，相關(guān)性良好，如圖2。煮沸法為陽(yáng)性的標(biāo)本，免提取法均為陽(yáng)性，煮沸法為陰性的標(biāo)本，有一例免提取法為陽(yáng)性，且結(jié)果為78IU/ML，低于煮沸法的最低檢出限100IU/ML。說(shuō)明免提取法的靈敏度比煮沸法要高。

圖1 線性評(píng)價(jià)

圖2 兩種方法比對(duì)

3 討論

核酸免提取HBV－DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)性能評(píng)估結(jié)果顯示：高、中、低濃度的精密度變異系數(shù)分 0．8%、1．51%和 2．89%低于煮沸法[8，11，12]；準(zhǔn)確度與標(biāo)準(zhǔn)品的偏差分別為0．02和0，明顯低于煮沸法[8，11，12]；線性驗(yàn)證的相關(guān)系數(shù) R=0．99，與煮沸法沒(méi)有區(qū)別；最低檢出限為30IU/ML，明顯低于煮沸法[8，11，12]的最低檢出限．核酸免提取方法可以及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)出低拷貝的病毒，達(dá)到早診斷，早治療的目的。對(duì)15例患者血清用兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示兩種方法相關(guān)性良好，說(shuō)明兩種方法都可應(yīng)用于臨床，核酸免提取法有更好的精密度，準(zhǔn)確度和靈敏度。本文使用核酸免提取方法精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、最低檢出限均符合YY/T1182－2010《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑（盒）》的要求，也符合廠家說(shuō)明書(shū)的要求。

目前，國(guó)內(nèi)試劑主要采用煮沸法提取HBVDNA，然后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DNA載量。 煮沸法測(cè)量 HBV－DNA 的性能驗(yàn)證報(bào)告[8，11，12，13]顯示煮沸法操作步驟繁多，需要高溫裂解及高速離心沉淀，很容易造成DNA裂解不完全或離心沉淀不徹底，而造成DNA提取及檢測(cè)結(jié)果誤差，吸取廢液轉(zhuǎn)移反應(yīng)管時(shí)也很容易造成DNA的丟失及交叉污染。免提取核酸方法使用的核酸釋放劑，無(wú)需高溫裂解，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在一個(gè)管中進(jìn)行，無(wú)需移液，減少了反應(yīng)步驟，縮短了操作時(shí)間，提高了工作效率。且避免了核酸的丟失、交叉污染和人工誤差，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、靈敏度和可重復(fù)性[14，15]。

綜上所述，核酸免提取HBV檢測(cè)方法具有精密度高，準(zhǔn)確度好，靈敏度好，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)操作及檢測(cè)性能能較好地滿足臨床需求。