羅藝，張洪德，陳思祖，徐文莉，李康，廖長征

(深圳市龍崗中心醫(yī)院中心實驗室，廣東 深圳 518116)

痛風(fēng)是尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)及其周圍結(jié)締組織而引起的最常見的炎性關(guān)節(jié)炎[1－4]，其根本原因是由于嘌呤代謝紊亂造成血尿酸水平過高或（和）尿酸排泄減少，病變主要發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、骨骺、肌腱、以及血管較稀少的膠原纖維組織和腎臟等部位。流行病學(xué)調(diào)查顯示：痛風(fēng)發(fā)病率急劇升高并呈低齡化趨勢[5]。研究表明，遺傳是原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病的重要因素之一，10%～35%的痛風(fēng)患者具有家族史，且患痛風(fēng)者家族成員中無癥狀高尿酸血癥發(fā)生率約為25%～70%[6]。ABCG2是一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛分布于具有分泌、排泄功能的組織中，其功能異常可導(dǎo)致尿酸排泄能力下降[7]。亞洲、白種、非洲人群中，ABCG2與高尿酸血癥和痛風(fēng)的最強關(guān)聯(lián)位點均為rs2231142位點，該位點可引起ABCG2蛋白141位谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?(Q141K)。高分辨率熔解曲線技術(shù)(high resolution melting，HRM)是一種利用熔解溫度判斷產(chǎn)物序列的技術(shù)，借助嵌入式飽和染料對DNA有較強結(jié)合能力和很低抑制作用的特點，可實現(xiàn)對擴增片段序列低至1個堿基改變的高靈敏檢測能力[8]。PCR產(chǎn)物的GC含量、長度、序列以及雜合情況決定了擴增片段熔解溫度及熔解曲線的形狀，現(xiàn)已廣泛用于檢測基因突變與分型的分子診斷、人類多種疾病相關(guān)遺傳多態(tài)性分析等方面。目前，已有文獻報道不同地域人群rs2231142位點單核苷酸多態(tài)性與痛風(fēng)的相關(guān)性，而華南地區(qū)人群尚無文獻報道，因此本文采用HRM技術(shù)分析rs2231142基因位點，研究其與原發(fā)性痛風(fēng)相關(guān)性，為痛風(fēng)的防控與治療提供參考。

1 資料與方法

1．1 一般資料 痛風(fēng)組426例樣本均選自2016年5月至2016年10月期間就診于自深圳市龍崗中心醫(yī)院門診的男性患者（21～65歲），所有患者均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)；對照組200例樣本均選自本院體檢科就診健康男性，排除惡性腫瘤、高尿酸、高脂血、高血壓、痛風(fēng)、糖尿病等疾病。本研究已通過本院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有參與本研究患者均知悉本試驗?zāi)康?。測量所有受試者血壓、體重和身高并計算出體重指數(shù)。采集空腹靜脈血，檢測血清尿酸、尿素氮、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、血糖等生化指標(biāo)。

1．2 試劑與儀器

1．2．1 核酸提取與純度檢測 全血DNA抽提試劑盒(杭州博日)；DNA濃度與純度檢測使用DN－1000（美國 Thermo Scientific）。

1．2．2 生化指標(biāo)檢測 C702全自動生化分析儀（瑞士Roche）

1．2．3 引物合成與PCR擴增 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；MeltDoctor HRM Master Mix試劑盒(美國Life Technologies)；PCR擴增儀為ViiA7實時熒光定量PCR儀(美國ABI)。

1．3 方法

1．3．1 樣本處理 采集 5ml EDTA抗凝外周靜脈血，取200μl抽提全血基因組DNA（操作步驟嚴(yán)格參照說明書），并測定DNA濃度與純度，保證核酸純度相同的條件下使用TE緩沖液稀釋至相同DNA 濃度(50ng/μl)，置 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 引物設(shè)計與 PCR擴增 使用Primer3軟件，根據(jù)rs2231142位點設(shè)計引物（見表1）并合成。使用MeltDoctor HRM Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系為：2X MeltDoctor HRM Master Mix 12．5μl，上游引物 0．5μl、下游引物 0．5μl、非標(biāo)記探針 0．5μl、DNA樣本1μl，去離子水補足體系總體積25μl，使用熒光定量PCR儀按照以下反應(yīng)條件擴增：Taq酶熱啟動（95℃，10min）；變性（94℃，30s）；退火（58℃，30s）；延伸（72℃，30s）；循環(huán) 35 次，72℃終末延伸5min。在60℃～95℃進行高分辨率熔解曲線分析，溫度每上升1℃采集25次熒光信號。當(dāng)擴增模板上存在堿基突變時，熔解溫度和熔解曲線形狀與野生型的樣本即會產(chǎn)生差別，分別設(shè)置已知型別的DNA模板作為標(biāo)準(zhǔn)對照品，通過將未知樣本HRM圖譜和標(biāo)準(zhǔn)品比對，即可得出樣本基因型，由此可實現(xiàn)對已知位點的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）和突變進行基因分型。表1所示ABCG2基因rs2231142位點的擴增引物

表1 PCR反應(yīng)引物及非標(biāo)記探針序列

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 19．0軟件；正態(tài)分布資料用（±s）表示；兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；兩組間基因型和等位基因構(gòu)成比采用χ2檢驗；擬合優(yōu)度χ2檢驗對痛風(fēng)組、對照組SNP位點進行 Hardy－Weinberg 平衡檢驗；P＜0．05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 rs2231142基因分型檢測結(jié)果 將樣本DNA擴增產(chǎn)物的HRM圖譜與已知基因型的標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進行比對，即可知道該樣品的基因型：若某個樣本僅有C等位基因的Tm值，即為CC型；僅含有A等位基因的Tm值，即AA型；若某樣本既含有C等位基因又有A等位基因的Tm值，即為雜合型A/C。

圖1 高分辨率熔解曲線rs2231142基因分型

2．2 rs2231142基因型與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)性分析表2所示為對照組與痛風(fēng)組rs2231142基因型與等位基因分布的對比情況，采用擬合優(yōu)度χ2檢驗顯示病例對照組中SNP位點基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(P＞0．05)；對照組與痛風(fēng)組CC、A/C、CC 基 因 型 攜 帶 頻 率 分 別 為 ：59．98%、31．02%、9．00%和 30．05%、52．82%、17．14%，對照組與痛風(fēng)組各基因型攜帶頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；痛風(fēng)組 rs2231142 A 等位基因攜帶頻率為 43．54%，對照組為 24．05%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)；AA基因攜帶者與A等位基因攜帶者痛風(fēng)對比CC基因攜帶者與C等位基因攜帶者發(fā)病風(fēng)險性分別提高了3．802倍和2．377倍，提示該基因位點與華南地區(qū)人群原發(fā)性痛風(fēng)具有相關(guān)性。

2．3 rs2231142位點與痛風(fēng)相關(guān)生理及生化指標(biāo)關(guān)聯(lián)性 rs2231142基因型與痛風(fēng)相關(guān)生化指標(biāo)進行了單因素方差分析，結(jié)果如表3所示，rs2231142多態(tài)性與收縮壓、尿素氮、肌酐、尿酸等生化指標(biāo)具有相關(guān)性。

3 討論

高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)是引起腎臟損害的重要因素之一，與糖、脂代謝紊亂關(guān)系密切，是心血管疾病的獨立危險因素。流行病學(xué)調(diào)查顯示HUA患病率呈逐年上升趨勢，目前我國HUA患者約1．2億，約占總?cè)丝诘?0%。HUA與痛風(fēng)的遺傳模式十分復(fù)雜，是由若干主效基因和多個微效基因共同控制并與環(huán)境相互作用而產(chǎn)生[4，9]。閻勝利[10]等調(diào)查顯示山東沿海地區(qū)40～49歲男性痛風(fēng)患病率最高，尤其南方及沿海經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)HUA 患病率可高達 5．0%～23．5%，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢，其原因可能與該地區(qū)居民攝入過多高嘌呤的海產(chǎn)品、動物內(nèi)臟、肉類食品以及大量飲用啤酒等因素有一定相關(guān)性。ABCG2大量表達于腎近曲小管刷狀緣膜上，起到排泄尿酸的作用，ABCG2基因Gln141賴氨酸位點基因突變已被證實為病因?qū)W突變。ABCG2基因賴氨酸等位基因編碼的分子能夠使尿酸轉(zhuǎn)運能力下調(diào)約50%[11]，導(dǎo)致核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域不穩(wěn)定，從而引起蛋白質(zhì)的表達降低[12]。Matsuo等[13]對705名日本痛風(fēng)男性患者及1887名健康對照男性的發(fā)病年齡與基因分型進行分析，結(jié)果顯示ABCG2功能嚴(yán)重失活者的痛風(fēng)發(fā)病年齡較ABCG2功能正常者提前6．5年。多項研究[14－15]顯示rs2231142多態(tài)性位點是一個重要的痛風(fēng)發(fā)病遺傳標(biāo)志。Wang等[16]研究顯示，中國漢族男性ABCG2 rs2231142位點AA基因型攜帶者痛風(fēng)發(fā)病率對比CC基因型痛風(fēng)發(fā)病率顯著增高，表明該位點基因多態(tài)性與中國漢族男性原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病關(guān)系密切。因此，本研究僅選取男性作為研究對象。

表2 痛風(fēng)組與健康對照組的rs2231142的等位基因和基因型分布例（%）

表3 rs2231142基因型與痛風(fēng)相關(guān)生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性

本研究選取626例華南地區(qū)漢族人群作為研究對象，結(jié)果顯示ABCG2基因rs2231142位點，痛風(fēng)患者攜帶高風(fēng)險基因型 （AA+A/C）的比率為69．96%， 正常人群僅為 40．02%；rs2231142 基因位點各基因型在正常人和痛風(fēng)患者攜帶頻率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。針對發(fā)病風(fēng)險評估發(fā)現(xiàn)AA基因型攜帶者痛風(fēng)發(fā)病風(fēng)險較CC基因攜帶者提高3．802倍，A等位攜帶者發(fā)病風(fēng)險與C等位基因攜帶者相比提高了 2．377倍。ABCG2基因的rs2231142位點多態(tài)性還影響收縮壓、尿素氮、肌酐、尿酸等指標(biāo)，此結(jié)果可解釋痛風(fēng)患者為何常合并代謝紊亂、高血壓等疾病，但相關(guān)作用機制還需作深入探討。本文所采用的HRM技術(shù)，僅需在反應(yīng)體系中增加飽和熒光染料，不需使用探針即可進行基因分型，該方法實現(xiàn)閉管操作，有效降低污染；同時只需要一種試劑在同一平臺上進行基因分型和突變掃描，因此，該技術(shù)具有操作簡單、成本低廉、耗時少、誤差小、高通量等優(yōu)點，可將其作為痛風(fēng)SNP位點快速篩查方法并推薦廣泛應(yīng)用于臨床。