蔣沁炆 ，俞鳳 ，陳艷慧 ，許秀華 ，方雪瑤 ，肖艷萍 ，曹星衛(wèi) ，鐘橋石 ，胡龍華

(1、南昌市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330009；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

肺炎克雷伯菌是臨床常見(jiàn)病原菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血流、傷口及顱內(nèi)等人類(lèi)多部位感染，是醫(yī)院感染監(jiān)控的重要菌株。由于碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的使用，在抗菌藥物的選擇壓力下，耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌（CRKP）甚至全耐藥的肺炎克雷伯菌不斷被發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌的高分離率及高耐藥性已成為臨床抗感染關(guān)注的重點(diǎn)。據(jù)報(bào)道[1]，在耐碳青霉烯類(lèi)類(lèi)腸桿菌菌中，CRKP列居第一。喹諾酮類(lèi)藥物是第一種完全由人工合成的的一類(lèi)廣譜、強(qiáng)效的抗菌藥物，其中氟喹諾酮類(lèi)藥物具有高效、服用方便、血藥濃度高、良好的生物利用度、組織分布廣和潛在毒副作用低等特點(diǎn)，已廣泛用于臨床抗感染治療[2]。臨床資料表明，隨著氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的使用，革蘭陰性桿菌極易對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物獲得耐藥性，傳統(tǒng)的藥物作用靶位改變和主動(dòng)外排耐藥機(jī)制[3]難于解釋耐藥率的快速上升速度。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qnr編碼的蛋白能夠保護(hù)喹諾酮類(lèi)藥物作用靶位而引起耐藥。革蘭陰性桿菌攜帶qnr基因可能是引起其對(duì)喹諾酮類(lèi)耐藥率快速上升的主要原因。本研究旨在對(duì)本地區(qū)臨床分離的CRKP進(jìn)行qnrA、qnrB、qnrS基因檢測(cè)，以了解其存在分布及耐藥情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2016年1月-2017年3月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床分離的129株碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥（亞胺培南/美洛培南）和喹諾酮類(lèi)耐藥（環(huán)丙沙星/左氧氟沙星）的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離株。

1.2 主要儀器和設(shè)備 全自動(dòng)微生物分析儀VITEK 2-Compact及配套鑒定卡（法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品）；PCR儀 （杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品）；二氧化碳培養(yǎng)箱；美國(guó)Thermo Scientific公司超低溫冰箱。PCR試劑、瓊脂糖、DNA Marker均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；PCR引物由杭州擎科生物工程有限公司合成。

1.3 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)所有菌株進(jìn)行鑒定，采用GN16革蘭陰性桿菌藥敏試驗(yàn)卡進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603。藥敏結(jié)果參照當(dāng)年度CLSI文件標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀及結(jié)果解釋。替加環(huán)素藥敏結(jié)果判讀參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督局（FDA）標(biāo)準(zhǔn)。藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)中介歸耐藥。

1.4 引物序列 引物由杭州擎科生物工程有限公司合成，qnrA、qnrB、qnrS引物參照文獻(xiàn)，具體見(jiàn)表1。

1.5 PCR擴(kuò)增與基因檢測(cè)采用煮沸法提取肺炎克雷伯菌總DNA，對(duì)qnrA、qnrB、qnrS耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系一致，即：DNA模板、正向引物（F）、反向引物（R）各 1μl，2×mix12.5μl，用無(wú)菌三蒸水定容至25μl。實(shí)驗(yàn)用引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min，94℃ 1min、66℃ 5min（退火溫度各反應(yīng)略 有 不 同 ）、72℃ 1min，32 個(gè) 循 環(huán) 后 72℃延 伸4min。5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并記錄，并將目的產(chǎn)物送杭州擎科生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST與已知序列比對(duì)以確定其基因型。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET5.6進(jìn)行藥敏數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 129株CRKP臨床分離株中，對(duì)對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物中環(huán)丙沙星耐藥率最高，達(dá)94.6%(123/129)，其次為左氧氟沙星，耐藥率為93.1%（121/129）。氨基糖苷類(lèi)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐藥率較一致，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的耐藥率分別為60.8%(79/129)、66.2%(86/129)和61.5%(80/129)。對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物耐藥率均大于95%。氨曲南的耐藥率為97.7%（126/129），耐藥率最低為替加環(huán)素32.8%(41/125)。耐喹諾酮類(lèi)抗菌藥物CRKP對(duì)臨床常用15種抗菌藥物的耐藥情況見(jiàn)圖1。

圖1 耐喹諾酮類(lèi)抗菌藥物CRKP對(duì)臨床常用15種抗菌藥物的耐藥情況

2.2 qnr基因檢測(cè)結(jié)果 129株CRKP檢測(cè)出qnr基因陽(yáng)性 98株，絕大多數(shù)為 qnrS（75.2%，97/129），僅1株為qnrB，未檢出qnrA，見(jiàn)圖2。qnrS基因陽(yáng)性株的標(biāo)本類(lèi)型以痰液為主，占52.6%（51/96），其次為血液和中段尿，為別為19.6%（19/97）和11.3%（11/97），其余來(lái)自膿液、傷口分泌物、膽汁、CVP 導(dǎo)管等。主要分布科室為綜合ICU18.6%（18/97）、急診 ICU15.5%（15/97）、 神經(jīng)外科 14.4%（14/97），其他分布于呼吸內(nèi)科、肝膽外科等病房。

圖2 qnrS基因陽(yáng)性株電泳圖譜，4、5號(hào)為qnrS基因陽(yáng)性株，1、2、3、6、7為qnrS 基因陰性株

3 討論

1998 年，Matinez-Martinez等[4]首次報(bào)道質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnr，其編碼的蛋白Qnr屬于五肽重復(fù)家族，可與Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶特異性結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥。有研究表明，Qnr蛋白可與DNA促旋酶結(jié)合，保護(hù)喹諾酮的作用靶位，不被喹諾酮類(lèi)藥物抑制，從而使細(xì)菌對(duì)喹諾酮發(fā)生低水平耐藥[5]。qnr基因的單獨(dú)存在可使菌株對(duì)喹諾酮藥物的敏感性降低，但可能并未達(dá)到具有臨床意義的喹諾酮耐藥水平或僅僅導(dǎo)致低水平的喹諾酮耐藥，但攜帶qnr基因的菌株在喹諾酮藥物的選擇壓力下容易發(fā)生染色體突變，或者含染色體突變的菌株在適宜的條件下可以捕獲qnr基因，在這兩種情況下菌株同時(shí)具有了質(zhì)粒和染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥機(jī)制，從而引起高水平喹諾酮耐藥[6]。

我們的研究結(jié)果顯示，129株CRKP耐藥及多重耐藥性非常嚴(yán)重，臨床幾乎無(wú)經(jīng)驗(yàn)抗感染藥物可選，對(duì)臨床常用的15種抗菌藥物耐藥率大于90%有10種，耐藥率最低的為替加環(huán)素（32．6%），對(duì)氨基糖苷類(lèi)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐藥率較一致（60%左右），對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率也極其嚴(yán)重，耐藥率均大于90%，這與戴爾寬[7]、周道平[8]等報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似，其對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率均大于90%甚至高達(dá)100%。而與杭亞平[2]等在2011－2012年對(duì)江西地區(qū)CRKP臨床分離株中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥基因檢測(cè)的研究中結(jié)果有所不同，這可能與近年喹諾酮類(lèi)藥物使用較廣泛或CRKP克隆株播散有關(guān)。此次研究中發(fā)現(xiàn)，CRKP攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的qnr基因檢出率較高，129株CRKP中有98株攜帶qnr基因，與胡偉[11]等報(bào)道類(lèi)似，qnr基因的檢出率為＞50%，而與鄭紅波[12]等結(jié)果不同，其qnr檢測(cè)陽(yáng)性率低。98株攜帶qnr基因菌株中有97株為qnrS，僅1株為qnrB，未發(fā)現(xiàn)qnrA。此結(jié)果與羅勇[9]等報(bào)道類(lèi)似，以qnrS檢出為主，而與黃支密[10]等報(bào)道的結(jié)果不同，其未檢出qnr基因。目前各地都未發(fā)現(xiàn)CRKP中攜帶qnrA基因的相關(guān)報(bào)道，但在碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物敏感的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)有qnrA基因[13－15]。

綜上所述，攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)qnr基因是CRKP臨床分離株對(duì)喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要原因，質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因水平傳播及菌株同源性播散可能是CRKP對(duì)喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥率快速上升的主要原因。必須強(qiáng)調(diào)的是，臨床抗感染應(yīng)以抗菌藥物敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，合理使用抗菌藥物，以降低臨床菌株的選擇壓力，同時(shí)臨床醫(yī)護(hù)工作者應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染意識(shí)，注意無(wú)菌操作及手衛(wèi)生，加強(qiáng)消毒，防止耐藥菌株的播散。