劉瑞弘 ，文奇 ，付倩 ，毛尚根 ，龔甜 ，徐剛

(1、新余市疾病預(yù)防控制中心，江西 新余338000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

2009年3月新型甲型H1N1流感病毒起源于墨西哥，并迅速傳遍全球，導(dǎo)致了本世紀(jì)第一次流感大流行[1，2]。經(jīng)基因序列分析，該病毒是一種4源重組的甲型流感病毒，由禽流感病毒、普通人流感病毒和2種豬流感病毒 （古典1918豬流感病毒、歐亞豬流感病毒）之間重排、重組形成[3-5]，且這種新型流感病毒的NA、M基因與歐亞豬流感病毒株高度同源[6]。最早人們發(fā)現(xiàn)新型甲型H1N1流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋 （Oseltamivir）敏感，對(duì)烷胺類藥物耐藥[7]。但隨著甲型H1N1流感病毒在人群中流行傳播，Oseltamivir耐藥株不斷被報(bào)道，截至2010年12月29日，全球已發(fā)現(xiàn)316株Oseltamivir耐藥株，而且這些毒株均發(fā)生了NA蛋白H275Y的突變[8]。本文參考日本學(xué)者Nukiwa N研發(fā)的RT-PCR-RFLP方法[9]，監(jiān)測(cè)新余市2013年-2015年分離出的部分甲型H1N1流感毒株，分析其NA蛋白是否發(fā)生H275Y突變，以篩查出Oseltamivir耐藥株。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 新余市2013年-2014年流感監(jiān)測(cè)工作中所采集的流感樣病例咽拭子標(biāo)本，采用狗腎傳代（MDCK）細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，隨機(jī)選擇新余市2013年分離的8株、2014年分離的7株甲型H1N1流感病毒作為研究對(duì)象。選擇江西省2009年-2011年分離的、已進(jìn)行了NA基因測(cè)序分析的2株甲型H1N1流感病毒株A/江西安源/SWL541/2009(H1)、A/江 西 東 湖/SWL11036/2010(H1)作為參考毒株，它們均為Oseltamivir敏感株[10]。

1．2 甲型H1N1流感毒株RNA提取 根據(jù)Qiagen公司的 RNeasy Mini Kit試劑盒（Cat．No：74106，Lot No：145022097）說明書提取流感病毒毒株RNA。

1．3 RT－PCR擴(kuò)增NA基因 采用Qiagen公司One Step RT－PCR Kit 試 劑 盒 (Cat：210212，Lot No：148047795) 進(jìn) 行 RT－PCR 反 應(yīng) 。 引 物 F：5′－AATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATGAT－3′；R：5′－CGATACTGGACCACAACTGC－3′；RT 反 應(yīng) 條件 ：60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30mim，95℃15min。 PCR 循 環(huán) 如 下 ：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，35 次循環(huán)，72℃ 10min， 在 MJ Research PTC－200儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為224bp。

1．4 RFLP分析 采用NEB公司BclI限制性酶（Lot No：6121305）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 50℃ 1h酶切。H275Y突變株不能被酶切，而敏感株（野生株）則被BclI酶切成198bp和26bp 2個(gè)片段。RFLP反應(yīng) 體 系 ：BclI 限 制 性 酶 0．45μl，10×NEB 緩 沖 液1μl，H2O 3．55μl，DNA 5μl。

1．5 電泳 One Step RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物采用3．0%瓊脂糖凝膠、北京六一產(chǎn)的DYY－6C型電泳儀電泳 1h，BIO－RAD公司 Universal HoodⅡ凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 2013年－2015年新余市流感病毒分離情況除2015年未分離到甲型H1N1外，每年B型、H3N2型和甲型H1N1流感病毒共同流行，并交替為優(yōu)勢(shì)株 （表1）。新余市2013年－2015年甲型H1N1 流感病毒分離情況分別為 45（3．66%）株、25（2．12%）株和 0（0%）株，年度之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），年度流行強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。

表1 2013年-2015年新余市流感病毒分離情況[n（%）]

2．2 NA基因的RT－PCR－RFLP結(jié)果分析 新余市15株甲型H1N1流行株（圖1和圖2）中，除毒株A/江西渝水/SWL1220/2014（H1）僅見大小約224 bp的RT－PCR產(chǎn)物（未被酶切消化）外，其余14株（含8株2013年、6株2014年流行株）和2株參考毒株的RT－PCR產(chǎn)物均被BclI限制性酶酶切成大小約為198bp、26bp的兩個(gè)片段，表明毒株A/江西渝水/SWL1220/2014（H1）系H275Y突變耐藥株，其他流行株均為敏感株。

圖1 新余市2013年部分甲型H1N1流感毒株RT-PCR產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物電泳圖譜

圖2 新余市2014年部分甲型H1N1流感毒株RT-PCR產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

Oseltamivir被WHO推薦用于治療甲型H1N1患者的一線藥物，也是目前全世界范圍內(nèi)最常使用的抗流感類藥物[11]。自甲型H1N1取代原有的H1N1成為季節(jié)性流感以來，有關(guān)該病毒對(duì)Oseltamivir耐藥的報(bào)道不斷增多。中國(guó)大陸最早報(bào)道的耐Oseltamivir甲型H1N1流感毒株為A/Hunan/SWL3/2009(H1)，系從湖南一輸入性病例標(biāo)本中分離得到[12，13]。此后我國(guó)陸續(xù)在浙江、云南和福建等省份的流感監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)個(gè)別Oseltamivir耐藥株，這些耐藥株共同的NA基因改變是在823位由C變成T，即NA蛋白發(fā)生了H275Y替換[14-16]。

以往耐藥基因突變位點(diǎn)最常用的檢測(cè)方法是基因測(cè)序，本次研究選用RT-PCR-RFLP方法，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，采用RT-PCR方法直接擴(kuò)增目標(biāo)片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化，電泳觀察結(jié)果。該方法巧妙地將上游引物設(shè)計(jì)成含有一個(gè)錯(cuò)配堿基的序列 （導(dǎo)致目的擴(kuò)增片段的820位堿基由T變成G），甲型H1N1流感Oseltamivir敏感株NA基因經(jīng)擴(kuò)增后得到目標(biāo)片段含有BclI酶切識(shí)別序列(TGATCA)，可被酶切成大小約為198bp、26bp的兩個(gè)片段，而H275Y突變株的擴(kuò)增片段在相應(yīng)位置序列為TGATTA，不被BclI酶識(shí)別消化，即可篩查出H275Y突變株。

近年來江西省內(nèi)部分疾控機(jī)構(gòu)對(duì)轄區(qū)內(nèi)甲型H1N1流感病毒分離株NA基因進(jìn)行了相關(guān)研究[21-24]，并未篩查到H275Y突變毒株。我們通過對(duì)2013年-2014年新余地區(qū)的15株甲型H1N1流感病毒NA基因進(jìn)行RT-PCR-RFLP分析，成功篩選出1株H275Y突變株 A/江西渝水/SWL1220/2014（H1），此突變株為江西省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的甲型H1N1流感耐Oseltamivir H275Y突變株，當(dāng)年已被國(guó)家流感中心所確定[17]。對(duì)該毒株分離標(biāo)本的病例情況進(jìn)行調(diào)查：患者為8個(gè)月大的幼兒，男，2014年3月9日因發(fā)燒于水北鎮(zhèn)一鄉(xiāng)村衛(wèi)生所就診，發(fā)熱不見好轉(zhuǎn)后第2d轉(zhuǎn)診到新余市人民醫(yī)院門診進(jìn)行治療，期間體溫在38.4℃-39℃之間，咽部、肺部特征陰性，未使用過Oseltamivir等抗流感藥物，門診醫(yī)生于3月12日采集了患兒的咽拭子。這些調(diào)查結(jié)果表明，該患兒感染上的H275Y甲型H1N1流感病毒并不是因?yàn)槭褂昧薕seltamivir等抗流感藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的。在關(guān)于全球2013-2014年度流感病毒對(duì)NAIs敏感性更新報(bào)告中提到，在甲型H1N1流感病毒中發(fā)生H275Y替換的比率已達(dá)到3.28%（169/5152），在曾攜帶H275Y甲型H1N1流感病毒的已康復(fù)患者中，有82%的人在采集標(biāo)本前未使用過NAIs抗流感藥物治療，說明這些突變毒株已具備自發(fā)產(chǎn)生和傳播的潛質(zhì)[18]。事實(shí)上，日本北海道札幌曾發(fā)生一起社區(qū)聚集性（39人感染）的H275Y甲型H1N1流感疫情事件，美國(guó)一年內(nèi)20個(gè)州共檢出57人也感染上這種病毒，這些病例均未經(jīng)治療或者不具有Oseltamivir暴露史[19，20]。盡管中國(guó)大陸對(duì)甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐藥株的報(bào)道數(shù)很少，但我們應(yīng)該加強(qiáng)Oseltamivir耐藥株的監(jiān)測(cè)力度，研究并制定防范措施以杜絕流感Oseltamivir耐藥株的擴(kuò)散傳播甚至群體性感染事件的發(fā)生。