文奇 ，周銀古 ，付倩 ，敖冬生 ，熊英 ，施勇

(1、新余市疾病預(yù)防控制中心，江西 新余338000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

流感病毒分為甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)，字母不僅反映了病毒被發(fā)現(xiàn)的時間順序，更反映了對人類的危害程度。目前人類A型流感中，新H1N1亞型自2009年秋季取代原有的季節(jié)性H1亞型后，與H3N2亞型共同成為A型流感的流行株。B型流感病毒不分亞型，但根據(jù)其抗原性和基因特征可以分為不同抗原譜系。自1983年以來，B型流感病毒分為兩個系：B-Victoria系和B-Yamagata系，代表株分別為B-Victoria/2/87和B-Yamagata/16/88，且兩個系流感病毒在全球共同流行[1]。C型流感以散發(fā)形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行[2]，因此沒有列入流感監(jiān)測范圍。本文就日常監(jiān)測中現(xiàn)存時間較長的H3N2亞型和B型流感病毒作為研究對象，通過NA基因序列分析法來闡述新余地區(qū)2013-2015年H3N2、B型流感病毒NA基因特性，為新余地區(qū)流感的預(yù)防控制及臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 選擇來自2013年-2015年不同時間內(nèi)流感監(jiān)測醫(yī)院或流感暴發(fā)疫情病例咽拭子標(biāo)本中分離到的 10株 H3N2、8株 B型 Victoria系（簡稱 BV）、15株 B型 Yamagata系（簡稱 BY）流感病毒進(jìn)行基因擴(kuò)增和測序，所選毒株均經(jīng)國家流感中心HA血凝抑制試驗復(fù)核確認(rèn)。

1.2 病毒RNA提取 采用德國Qiagen公司的RNeasy Mini Kit 試 劑 盒 （Cat.No：74106，Lot No：145022097）說明書提取病毒RNA。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增NA基因 采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，NA引物及反應(yīng)條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]，在BIO-RAD PTC-200儀器上進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 核苷酸序列測定 RT-PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化和雙向測序。

1.5 序列分析 采用DNAStar5.0、Mage5.0序列分析軟件（包）對測序文件的雙向序列進(jìn)行拼接、對比和遺傳進(jìn)化分析，選取2012年-2014年北半球疫苗推薦株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)、2014年-2015年北半球疫苗株 A/Texas/50/2012(H3N2)、2009年-2012年北半球疫苗株B/Brisbane/60/2008（BV）、2012年-2013年北半球疫苗株B/Wisconsin/01/2010（BY）、2013年-2015年北半球疫苗株B/Massachusetts/02/2012（BY）作為對比毒株，從 Influenza Research Database中下載NA基因序列，收錄 號 分 別 為 KJ942682、KC892237、CY073894、JN993033、KC891815。

2 結(jié)果

2.1 H3N2亞型NA基因特性分析

2.1.1 核苷酸進(jìn)化和同源性 10株H3N2分離株NA基因核苷酸雙向序列經(jīng)拼接、對比后，均獲得長度為1407bp的編碼序列，編碼469個氨基酸，對其構(gòu)建核苷酸進(jìn)化樹，以疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)作為參照毒株，將獨(dú)特的氨基酸替換位點標(biāo)記于核苷酸進(jìn)化樹上（圖1）。可以看出NA基因核苷酸進(jìn)化樹分為2支（Clade），Clade 1內(nèi)的毒株可進(jìn)一步分為2組 (Group)，2013年分離株與疫苗株位于Group 1中，2014年分離株位于Group 2中，2015年分離株單獨(dú)構(gòu)成Clade 2，2015年分離株與疫苗株親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。與疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)相比較，2013年、2014年、2015年分離株的NA基因同源性分別為99.3%～99.4%、99%、98.6%～98.8%；與疫苗株A/Texas/50/2012(H3N2)相比較，2013 年、2014 年、2015 年分離株的NA基因同源性分別為99.6%～99.7%、99.2%～99.3%、99%～99.2%。

2.1.2 氨基酸替換位點 Group 1未形成共同的變異位點，Group 2具有V412I替換位點，而在Clade 2上有4個替換位點，分別是S245N、S247T、T267K和I380V。

2.1.3 NA蛋白分子上二硫鍵位點和糖基化位點二硫鍵通常指在多肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸（C）殘基中的化學(xué)鍵，而潛在糖基化位點由分子中的天冬酰胺（N）所構(gòu)成。H3N2亞型毒株NA蛋白序列分析結(jié)果表明，與參照毒株相比，所有分離株與疫苗株NA蛋白中二硫鍵位點完全一致，分別是21、53、78、92、124、129、175、183、193、230、232、237、278、280、289、291、318、337、417、421、447 位，但糖基化位點情況則不太相同，參照毒株和分離株A/JiangxiYushui/1359/2015(H3)只有6個共同糖基化位點， 即 61、70、86、146、200、234 位， 其余H3N2分離株除了上述6個糖基化位點外在329位增加了1個糖基化位點。

2.1.4 抗原決定簇 至今已知N2蛋白有7個抗原決定簇，它們是153位、197～199位、328～336位、339～347位、367～370位、400～403位和431～434位[4]。根據(jù)我們的分析結(jié)果顯示，除了分離株A/JiangxiYushui/1359/2015(H3)在 329位是蘇氨酸（T）致使它在328～336位抗原決定簇有所不同，其余分離株7個抗原決定簇完全相同。

2.1.5 NA蛋白耐藥相關(guān)位點 對照A型流感病毒NA蛋白酶催化活性位點（N2 Numbering）（R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371 和 Y-406） 和輔助位點 （E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、E-227、H-274、E-277、N-294 和 E-425），新余地區(qū)10株H3N2亞型分離株在以上位點未發(fā)生突變，均對NAIs敏感。

圖1 H3N2亞型流感病毒NA基因核苷酸進(jìn)化樹及其氨基酸序列變異位點

2.2 B型NA基因特性分析

2.2.1 核苷酸進(jìn)化和同源性 23株B型病毒NA基因核苷酸雙向序列同樣經(jīng)拼接、對比后均獲得長度為1398bp的編碼序列，對其構(gòu)建核苷酸進(jìn)化樹，推導(dǎo)出氨基酸序列（466個氨基酸位點），將氨基酸差異位點一并標(biāo)于核苷酸進(jìn)化樹上（圖2）。核苷酸進(jìn)化樹分為2個支 （Clade），Clade 1再分為2組（Group），8株 BV 分離株與 A/JiangxiYushui/131/2015(BY)位于Group 1，余下8株、6株BY分離株分別位于Group 2、Clade 2。與疫苗株B/Brisbane/60/2008（BV） 進(jìn)行比較，8株 BV分離株、A/JiangxiYushui/131/2015(BY)、Group 2中 8株 BY 分離株NA基因的同源性分別為98.8%～99%、99.1%、96.5%～96.9%；與疫苗株B/Wisconsin/01/2010（BY）進(jìn)行比較，Clade 1中9株BY分離株、Clade 2中6株BY分離株NA基因的同源性分別為94.4%～95%、98.3%～99%。綜合B型流感HA血凝抑制試驗、NA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹和同源性分析結(jié)果以及我們先前有關(guān)B型流感HA1基因的研究結(jié)果[26]，表明Clade 1中9株BY分離株為種系間BY-HA/BV-NA的重配毒株。

2.2.2 氨基酸序列差異位點 以疫苗株B/Brisbane/60/2008（BV）作為參照毒株，Group 1所有分離株均發(fā)生S259R、N340D和K343E替換，所有BV分離株另發(fā)生E358K替換；Group 2所有分離株均發(fā)生 I262M、V271T、K272Q、N329D、D342G、M375K和D384N替換，Clade 2所有毒株與疫苗株B/Brisbane/60/2008（BV）相比較，至少在 148、198、219、235、244、373、389、392、396、436 位點上存在差異。

2.2.3 NA蛋白分子上二硫鍵位點和糖基化位點序列分析表明疫苗株和所有分離株均具有9對二硫鍵和4個潛在糖基化位點，形成二硫鍵的位點即 54、87、122、127、182、229、231、236、251、277、279、289、291、318、337、420、424、447 位，4 個糖基化位點分別是56、64、144、284位，所有B型分離株NA蛋白上的二硫鍵位點和糖基化位點非常保守。

2.2.4 抗原決定簇 BNA蛋白上有8個抗原決定簇， 分 別 在 125、148、186、198、244、248、271、272位[5]。新余地區(qū)BY分離株與疫苗株B/Brisbane/60/2008（BV）相比，反映在8個抗原決定簇上的差異如下：Clade 2 中所有毒株在 125、148、198、244 位分 別 為 N →K/T、G →E、N →S、S→P， 除 B/JiangxiYushui/1221/2014（BY）外其余毒株在 186、248位分別是K→R、V→I；Group 2中所有毒株在271、272位分別是V→T、K→Q。從前述分析來看，Clade 1中9株BY分離株與疫苗株B/Brisbane/60/2008（BV）具有相同抗原決定簇的數(shù)量不小于6個，這個分析結(jié)果進(jìn)一步說明它們是種系間的重配病毒。

2.2.5 NA蛋白耐藥相關(guān)位點 根據(jù)B型流感病毒NA蛋白酶催化活性位點 （B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、R-374 和 P-406） 和輔助位點 （E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276 和 N-294，E-428）以及其他相關(guān)位點 E-105、G-108、G-141、N-144、S-249、T-325、R-374、G-407， 分析新余地區(qū)23株B型分離株NA基因氨基酸序列，所有B型分離株在相應(yīng)位點未發(fā)生替換，仍然對神經(jīng)氨酸酶抑制劑保持敏感。

3 討論

圖2 B型流感病毒NA基因核苷酸進(jìn)化樹及其氨基酸序列位點差異

NA是流感病毒基因組第6個片段所編碼，其單體包含四個部分：胞內(nèi)域、跨膜區(qū)、莖部和頭部[6]。不同NA亞型和不同毒株之間氨基酸殘基數(shù)在胞內(nèi)域、跨膜區(qū)是固定的，而在莖部、頭部是變動的，其中頭部約為390個氨基酸包括酶活性中心位點、抗原決定簇和部分糖基化位點[7-9]。NA在病毒膜上以四聚體的形式存在，NA單體在宿主細(xì)胞內(nèi)合成后，首先依靠分子間二硫鍵形成二聚體，再通過適當(dāng)?shù)奶腔纬伤木垠w[7]。在NA三維結(jié)構(gòu)中四聚體的頭部呈蘑菇樣，通過細(xì)長的莖部連接到病毒膜[10]。

NA在病毒脫離宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用。病毒入侵細(xì)胞時血凝素（HA）分子末端的唾液酸殘基（SA）與細(xì)胞HA受體分子表面的糖基團(tuán)（糖蛋白/糖脂質(zhì)） 以 α-2，6或 α-2，3糖苷鍵相鏈接最終完成感染。病毒成熟后NA催化水解相同糖苷鍵使病毒顆粒脫離宿主細(xì)胞，感染新的細(xì)胞以幫助病毒擴(kuò)散[11]。NIAs類藥物通過與NA上的特定結(jié)構(gòu)域競爭性、可逆性結(jié)合，降低水解酶的活性從而阻止病毒顆粒脫離細(xì)胞向外擴(kuò)散。目前在臨床使用的NIAs有三種：奧斯他韋、扎那米韋和帕拉米韋。除了帕拉米韋為新研制藥物外，NIAs已經(jīng)在臨床上運(yùn)用近二十年[12]。然而隨著NAIs對抗流感病毒的治療使用，耐藥毒株陸續(xù)被國外發(fā)現(xiàn)并報道出來，認(rèn)為這些耐藥株的出現(xiàn)與流感病毒NA上酶活性位點等氨基酸位點突變有關(guān)，如R152K、D198N、I222T、H274Y、N294S、E105K、G109E、E110K、S250G、G402S[13-17]。 Colman 等人研究認(rèn)為，H3N2亞型流感病毒的NA基因酶催化活性位點（R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371 和 Y-406） 和輔助位點 （E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、E-227、H-274、E-277、N-294和E-425）、B型流感病毒的NA基因酶催化活 性 位點 （R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、R-374 和 P-406）和輔助位點（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276 和 N-294，E-428）以及其他相關(guān)位點E-105、G-108、G-141、N-144、S-249、T-325、R-374、G-407發(fā)生一個或多個氨基酸替代都可能引起NIAs敏感性下降甚至完全無效[18]。國內(nèi)有關(guān)監(jiān)測到H3N2、B型毒株對NAIs產(chǎn)生耐藥的報道并不多見，僅限于秦劍秋、梁麗君和刑小會等人的分析研究[19-21]。

本文從基因進(jìn)化、共同氨基酸差異、二硫鍵位點、糖基化位點、抗原決定簇和耐藥相關(guān)位點多個角度入手，對新余地區(qū)2013年-2015年H3N2、B型流感病毒分離株的NA基因特性進(jìn)行探討。從分析結(jié)果來看，與疫苗株A/Vitorvia/361/2011(H3N2)相比較10株H3N2型分離株NA基因同源性均為98.6%以上，但同源程度隨年代跨度緩慢下降；在NA氨基酸序列上，H3N2分離株的二硫鍵位點和耐藥相關(guān)位點均相同，除分離株A/JiangxiYushui/1359/2015(H3)外，其他H3N2分離株在329位增加了1個糖基化位點，這也導(dǎo)致它們在328～336位抗原決定簇有所不同。糖基化位點的增加可能會掩蓋抗原位點，成為病毒逃避宿主免疫壓力的一種方式[20]。所有B型分離株NA蛋白的二硫鍵位點、糖基化位點和耐藥相關(guān)位點均未發(fā)生改變，但NA抗原決定簇在兩個譜系間差異較大。60%(9/15)的BY系流感毒株為BY-HA/BV-NA重配毒株。B型流感病毒中發(fā)現(xiàn)重配毒株在近幾年屢有報道[22-24]，這可能與它們在人群中共同流行、進(jìn)化致使兩者增加了基因重配的機(jī)會有關(guān)[25]。有關(guān)共同氨基酸差異位點方面，在H3N2分離株上只體現(xiàn)出不同的進(jìn)化分支，而在B型分離株還可以反映出兩系在抗原決定簇上的差異。本文的分析結(jié)果提示新余地區(qū)H3N2、B型所有分離株NA基因與相應(yīng)疫苗株同源性較高；在NA氨基酸序列上除分離株A/JiangxiYushui/1359/2015(H3)外，其余同型別的分離株二硫鍵位點、糖基化位點和耐藥相關(guān)位點是相同的，而抗原決定簇在H3N2分離株間也是一致的但在B型不同系譜間差異相當(dāng)大；所有分離株仍然顯示出對NAIs類藥物敏感，但我們應(yīng)該持續(xù)監(jiān)測其變化情況以便在流感防治工作中作出正確的決策。