顧靜莉 李文娜 曹 勤 黃 融 馬嘉驊 顧偉威 張慶華 范竹萍# 宋 凱

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院健康保健中心1(200127) 國家人類基因組南方研究中心上海市疾病與健康基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2 上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司3

背景：結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，早期診斷和治療能提高整體生存率，血清腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測有望提高篩查效率。目的：探討血清胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和癌胚抗原(CEA)三種腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值。方法：采用固相抗體芯片檢測16例結(jié)直腸癌患者和16名正常人血清中13種腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)。以液相懸浮芯片進(jìn)一步驗(yàn)證81例結(jié)直腸癌患者和14名正常人中高表達(dá)的腫瘤標(biāo)記物。采用ROC曲線評(píng)價(jià)上述指標(biāo)單項(xiàng)檢測和聯(lián)合檢測對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值。結(jié)果：與正常人相比，結(jié)直腸癌患者血清IGFBP-2、IL-8和CEA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。這三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測對(duì)結(jié)直腸癌的診斷敏感性為87.7%，特異性為92.9%， AUC為0.933，均高于單指標(biāo)檢測。結(jié)論：IGFBP-2、IL-8、CEA聯(lián)合檢測可提高結(jié)直腸癌的診斷效率，可作為臨床診斷結(jié)直腸癌的輔助方法。

結(jié)直腸癌是當(dāng)今最常見的疾病之一，死亡率位居惡性腫瘤第二位。全球每年約120萬例患者被確診為結(jié)直腸癌，超過50萬例死于結(jié)直腸癌，結(jié)直腸癌已成為一個(gè)公共問題。雖然結(jié)直腸癌的診斷和治療已取得較大的進(jìn)展，但5年生存率僅50%，治療效果仍有待提升[1-3]。早期診斷并及時(shí)治療能提升結(jié)直腸癌整體的治療效果和生存率，對(duì)延長患者生命、提高生存質(zhì)量有重要意義。

內(nèi)鏡檢查及其病理活檢是目前診斷結(jié)直腸癌的主要方法[4-5]，但該法存在技術(shù)要求高、費(fèi)用高、患者耐受性低等問題。糞便隱血試驗(yàn)是一種常用的結(jié)直腸癌診斷方法，然而其準(zhǔn)確性并不理想[2]。血清腫瘤標(biāo)記物檢測具有操作簡便快捷、非侵入性、檢測樣本易獲得、成本低等優(yōu)勢，可作為篩查結(jié)直腸癌的有效手段，但目前仍缺乏診斷效率高的單項(xiàng)標(biāo)記物。本研究利用固相抗體芯片對(duì)13個(gè)血清腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行篩選，并進(jìn)一步使用液相懸浮芯片對(duì)篩選出的指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在探討胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和癌胚抗原(CEA)聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值。

材料與方法

一、檢測對(duì)象

收集2016年9月—2017年3月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院收治的173例結(jié)直腸癌患者血清樣本。臨床確診采用改良的Dukes分期，選用結(jié)直腸癌B、C、D期的患者血清樣本。其中男103例，女70例，年齡19～91歲，平均57.5歲。以39名體檢正常者血清樣本作為對(duì)照，其中男22名，女17名，年齡19～69歲，平均40.23歲。

二、檢測方法

1. 分離血清：采集空腹靜脈血5 mL，靜置，室溫900×g離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。

2. 固相抗體芯片實(shí)驗(yàn)：選取16例結(jié)直腸癌患者、16名正常人行固相抗體芯片實(shí)驗(yàn)。固相抗體芯片AAH-CUST(H13)委托美國Raybiotech公司定制。芯片上包含13種腫瘤標(biāo)記物抗體：CEA、糖鏈抗原19-9(CA19-9)、CA15-3、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IGFBP-2、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、IL-8、IL-1ra、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、人脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2、上皮細(xì)胞黏附分子1(TROP1)。芯片檢測實(shí)驗(yàn)按照Raybiotech公司芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。使用封閉液將芯片室溫封閉30 min，選取50 μL 血清與50 μL封閉液混勻后與封閉后的芯片4 ℃ 雜交過夜。洗滌芯片后加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，室溫反應(yīng)2 h后與鏈霉親和素偶聯(lián)的熒光染料室溫反應(yīng)2 h。洗滌芯片后甩干，使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描。

使用去除背景的熒光信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱反映了該指標(biāo)的表達(dá)情況。每種抗體設(shè)置兩次技術(shù)重復(fù)，取均值。以Positive Control歸一化樣本間數(shù)據(jù)，并使用歸一化后數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白表達(dá)差異。

3. 液相懸浮芯片實(shí)驗(yàn)：選取157例結(jié)直腸癌患者、23名正常人行液相懸浮芯片實(shí)驗(yàn)。采用Bio-Plex MAGPIX System (Bio-Rad)液懸微珠芯片平臺(tái)，芯片委托Millipore公司定制。使用HIGFBMAG-53K試劑盒檢測IGFBP-2水平，HCCBP1MAG-58K試劑盒檢測CEA、IL-8和VEGF水平。芯片檢測實(shí)驗(yàn)按照Millipore公司芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。反應(yīng)孔中加入微珠，洗滌。加入樣品，4 ℃避光孵育過夜。洗滌，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，室溫避光孵育1 h。洗滌，加入藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫避光孵育30 min。洗滌，送入已校正的液相懸浮芯片分析儀中讀取結(jié)果。

使用去除空白對(duì)照的熒光信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱反映了該指標(biāo)的表達(dá)情況，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5和Medcalc 15.2.2統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。聯(lián)合診斷采用Logistic回歸分析，以ROC曲線下面積(AUC)、敏感性和特異性評(píng)價(jià)指標(biāo)的診斷價(jià)值。AUC的比較采用中數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、固相抗體芯片篩選差異表達(dá)的蛋白

固相抗體芯片結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者血清IGFBP-2(P=0.016 7)、IL-8(P=0.013 6)、CEA(P=0.001 4)和VEGF(P=0.007 9)表達(dá)水平顯著高于正常人(圖1)。

二、液相懸浮芯片驗(yàn)證和評(píng)價(jià)高表達(dá)的指標(biāo)

采用液相懸浮芯片對(duì)81例結(jié)直腸癌患者和14名正常人進(jìn)一步檢測血清IGFBP-2、IL-8、CEA和VEGF表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者血清IGFBP-2(P=0.015 3)和IL-8(P=0.005 7)表達(dá)顯著高于正常人；81例結(jié)直腸癌患者中52例CEA表達(dá)高于正常人，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩組VEGF表達(dá)無明顯差異(圖2)。

ROC曲線分析顯示，IGFBP-2單項(xiàng)檢測診斷結(jié)直腸癌的敏感性為82.7%，特異性為92.9%，AUC為0.887；IL-8單項(xiàng)檢測診斷結(jié)直腸癌的敏感性為86.4%，特異性為71.4%，AUC為0.852；CEA單項(xiàng)檢測診斷結(jié)直腸癌的敏感性為37.0%，特異性為100%，AUC為0.698。IGFBP-2、IL-8和CEA聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的敏感性為87.7%，特異性為92.9%，AUC為0.933(圖3)。由此可見，與單項(xiàng)指標(biāo)檢測相比，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性。

結(jié)合概率計(jì)算公式P=1/[1+e-Logit(P)]，采用交互點(diǎn)圖(interactive dot diagram)分析得到概率閾值為0.739 1(圖4)。若樣本檢測的概率>0.739 1，預(yù)測其為結(jié)直腸癌患者；反之，則預(yù)測其為非結(jié)直腸癌患者。

三、三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效率

為檢驗(yàn)這三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的效率，使用液相懸浮芯片對(duì)76例結(jié)直腸癌患者和9名正常人血清IGFBP-2、IL-8和CEA水平進(jìn)行檢測。根據(jù)回歸方程Logit(P)=-1.339 9+0.000 143 27×IGFBP-2+0.000 257 11×CEA+0.001 072 3×IL-8和概率計(jì)算公式預(yù)測每例入選者罹患結(jié)直腸癌的概率。結(jié)果顯示對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)判的準(zhǔn)確率為80.3%(61/76)，正常人為100%(9/9)。

圖1 結(jié)直腸癌患者和正常人血清中差異蛋白的表達(dá)(固相抗體芯片實(shí)驗(yàn))

圖2 液相懸浮芯片實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)直腸癌患者和正常人血清中差異表達(dá)的蛋白

圖3IGFBP-2、IL-8和CEA單項(xiàng)檢測和聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線分析

圖4 三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合分析的預(yù)測概率閾值

討 論

目前已發(fā)現(xiàn)的與結(jié)直腸癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物數(shù)目眾多，但絕大多數(shù)均未能運(yùn)用于臨床診斷中。IGFBP-2、IL-8和CEA均屬于腫瘤標(biāo)記物[6]。人IGFBP-2含289個(gè)氨基酸，蛋白結(jié)構(gòu)域包含保守的氨基端和羧基端區(qū)域[7]。有研究表明，IGFBP-2對(duì)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的各種腫瘤均有促進(jìn)作用[8]。IGFBP-2的Arg-Gly-Asp基序能與腫瘤細(xì)胞膜的整合素特異性結(jié)合，從而減少細(xì)胞間黏附，增加細(xì)胞的移動(dòng)性[9]。此外，IGFBP-2入核后能通過激活VEGF來促進(jìn)血管生成，從而產(chǎn)生致瘤作用[10-11]。IL-8是一種趨化因子。在正常人體內(nèi)主要參與炎癥和體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)。有研究表明，IL-8可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而腫瘤細(xì)胞本身也可分泌IL-8，促進(jìn)腫瘤 的生長和轉(zhuǎn)移，如鼻咽癌[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、結(jié)直腸癌[15]、腎癌[16]等惡性腫瘤中IL-8的基因表達(dá)升高，產(chǎn)生大量IL-8，參與構(gòu)成腫瘤生存的微環(huán)境。CEA是一種蛋白多糖復(fù)合物，其大小根據(jù)糖基化程度的不同而有所差異，為180～200 kDa(1 Da=0.992 1 u)[17]。CEA通常由胎兒胃腸道產(chǎn)生，與細(xì)胞黏附相關(guān)。目前已廣泛作為診斷結(jié)直腸癌的血清檢測指標(biāo)，但敏感性并不十分理想[18-21]。

蛋白芯片具有高通量、操作簡單、所需樣本量小的特點(diǎn)。本研究采用固相抗體芯片的檢測方法，從13個(gè)腫瘤相關(guān)標(biāo)記物中篩選出4項(xiàng)在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的指標(biāo)。隨后增加樣本量并采用液相懸浮芯片進(jìn)行驗(yàn)證，確定結(jié)直腸癌中IGFBP-2、IL-8和CEA表達(dá)高于正常人。進(jìn)一步通過ROC曲線和Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，與單指標(biāo)檢測相比，三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測可提高診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性；IGFBP-2、IL-8和CEA單項(xiàng)檢測的AUC分別為0.887、0.852和0.698，而三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的AUC升至0.933。

本研究采用三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌，在保證較高特異性(92.9%)的同時(shí)具有較高的敏感性(87.7%)，是對(duì)目前臨床診斷結(jié)直腸癌手段的一種補(bǔ)充，彌補(bǔ)了糞便隱血試驗(yàn)、內(nèi)鏡檢查、單項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物診斷結(jié)直腸癌的不足，同時(shí)兼具腫瘤標(biāo)記物檢測所具備的操作簡便快捷、非侵入性、檢測樣本易獲得、成本低等優(yōu)勢，是一種易被接受的診斷方法。

本研究42例結(jié)直腸癌患者在臨床檢測了血清CEA、CA19-9、CA72-4、AFP和鐵蛋白含量，分別有100%(42/42)、95.2%(40/42)、83.3%(35/42)、92.9%(39/42)和95.2%(40/42)處于臨床認(rèn)定的正常值范圍內(nèi)。說明臨床上單獨(dú)檢測這些指標(biāo)對(duì)診斷結(jié)直腸癌的敏感性太低。本研究通過聯(lián)合檢測CEA與IGFBP-2、IL-8，大大提高了診斷結(jié)直腸癌的敏感性，可作為臨床診斷結(jié)直腸癌的輔助方法。

但本研究未對(duì)結(jié)直腸癌病例組進(jìn)行分級(jí)分層分析，未在結(jié)直腸癌不同的病理階段、病理類型中檢測這三種腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)，以及聯(lián)合檢測的診斷意義。在行固相抗體芯片實(shí)驗(yàn)篩選相關(guān)腫瘤標(biāo)記物時(shí)所納入的樣本量較少，未來可擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究相關(guān)腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系，使研究結(jié)果更精準(zhǔn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，CEA與IGFBP-2、IL-8單項(xiàng)檢測診斷結(jié)直腸癌的臨床價(jià)值不高，但這三種腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測可明顯提高診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性，可作為診斷結(jié)直腸癌的輔助方法。

致謝感謝上海東方醫(yī)院葉勤、上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司周志強(qiáng)、計(jì)佳莉、梁丁芳、康林、張春秀等給予的幫助。