楊 陽(yáng) 張 舒 周思琦 楊 杰 呂 瑛 鄒曉平

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008) 南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科2

背景：溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4)已被證實(shí)參與了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程，但其在胃癌中的作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。目的：探討B(tài)RD4、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法：收集進(jìn)展期胃癌組織83例、早期胃癌組織45例、胃癌前病變組織42例和正常胃黏膜上皮組織38例，采用免疫組化方法檢測(cè)BRD4、MMP-13表達(dá)，分析進(jìn)展期胃癌組織中兩者表達(dá)的相關(guān)性以及兩者與腫瘤臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：BRD4和MMP-13在進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于早期胃癌、癌前病變和正常胃黏膜上皮組織(P<0.05)，兩者表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.258, P=0.019)，且表達(dá)陽(yáng)性者預(yù)后顯著差于表達(dá)陰性者(P<0.05)。BRD4表達(dá)與進(jìn)展期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，多因素分析顯示其為影響進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=10.696, 95% CI: 1.137～100.609, P=0.038)。結(jié)論：胃癌組織中高表達(dá)的BRD4可能通過(guò)調(diào)控MMP-13信號(hào)通路促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展，影響患者預(yù)后。

溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)為溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)(bromodomain and extraterminal, BET)家族成員(包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT)，含有兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域和一個(gè)超末端結(jié)構(gòu)，可特異性識(shí)別組蛋白中乙?；嚢彼岬谋Ｊ氐鞍捉Y(jié)構(gòu)域，通過(guò)與染色質(zhì)中的乙酰化賴氨酸結(jié)合，促使染色質(zhì)重塑因子、轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)蛋白富集至特定的基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)下游眾多靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)BRD4在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展中扮演重要角色，可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、腫瘤血管生成、腫瘤干細(xì)胞自我更新等過(guò)程[1-6]。

癌細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinases, MMPs)在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中居關(guān)鍵地位，其主要作用為破壞基質(zhì)降解平衡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破組織屏障，侵襲周?chē)M織和轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處組織，同時(shí)介導(dǎo)腫瘤新生血管形成，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，影響腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。MMP-13是MMPs家族的重要一員，處于MMPs激活過(guò)程的中樞，在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)。

胃癌是嚴(yán)重影響我國(guó)乃至全球人民健康的惡性腫瘤之一。盡管包括手術(shù)、化療和放療在內(nèi)的腫瘤治療手段不斷改進(jìn)，但胃癌的臨床綜合治療效果仍不理想[8]。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)不同胃組織中的BRD4、MMP-13表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為其作為胃癌早期診斷、預(yù)后判斷指標(biāo)提供依據(jù)。

材料與方法

一、臨床資料

分別選取南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院普通外科手術(shù)切除、消化內(nèi)科內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD)切除或胃鏡活檢獲得的四類胃組織納入研究：①進(jìn)展期胃癌組織83例(2008—2011年手術(shù)切除)，病理證實(shí)癌組織浸潤(rùn)已超過(guò)黏膜下層，侵入胃壁肌層和漿膜層；②早期胃癌組織45例(2006—2008年手術(shù)切除)，病理證實(shí)癌組織局限于黏膜層和黏膜下層；③胃癌前病變組織42例(2010—2012年ESD切除)，病理證實(shí)為低級(jí)別或高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；④正常胃黏膜上皮組織38例(2013年內(nèi)鏡活檢)，病理證實(shí)為非萎縮性胃炎。入選病例病史資料和隨訪資料完整，所有胃癌患者術(shù)前均未行化療和放療。研究方案經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1. 資料采集：通過(guò)查閱病史和門(mén)診、電話隨訪采集患者臨床病理資料和預(yù)后信息。吸煙史定義為術(shù)前吸煙超過(guò)2年，每日超過(guò)2支；飲酒史定義為術(shù)前飲酒超過(guò)2年，每日乙醇攝入量大于15 g。

2. 免疫組化染色：4 μm厚石蠟包埋病理切片65 ℃烤片30 min；二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)并維持沸騰10 min，自然冷卻；山羊血清37 ℃封閉20 min；于濕盒中加入一抗(BRD4抗體，Bethyl Laboratories，1∶1 000稀釋；MMP-13抗體，Abcam plc.，1∶200稀釋)，4 ℃過(guò)夜；加入相應(yīng)二抗，37 ℃孵育40 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。

結(jié)果判讀：由兩名有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。BRD4免疫陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，MMP-13免疫陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)。每張切片于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算BRD4或MMP-13陽(yáng)性細(xì)胞在同類細(xì)胞中所占比例。陽(yáng)性細(xì)胞≤5%記0分(陰性)，5%～30%記1分(弱陽(yáng)性)，30%～60%記2分(中等陽(yáng)性)，>60%記3分(強(qiáng)陽(yáng)性)。評(píng)分0分判定為陰性，評(píng)分1～3分判定為陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量間相關(guān)性的分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；預(yù)后相關(guān)因素的分析采用Kaplan-Meier生存曲線(log-rank檢驗(yàn))和Cox回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BRD4、MMP-13在不同胃組織中的表達(dá)

83例進(jìn)展期胃癌組織中，70例(84.3%)BRD4表達(dá)陽(yáng)性，其中27例(32.5%)為強(qiáng)陽(yáng)性；80例(96.4%)MMP-13表達(dá)陽(yáng)性，其中26例(31.3%)為強(qiáng)陽(yáng)性。而在38例正常胃黏膜上皮組織中，分別僅10例(26.3%)和7例(18.4%)BRD4和MMP-13表達(dá)陽(yáng)性。早期胃癌和癌前病變組織中BRD4表達(dá)陽(yáng)性率分別為73.3%(33/45)和81.0%(34/42)，MMP-13表達(dá)陽(yáng)性率分別為55.6%(25/45)和50.0%(21/42)。BRD4、MMP-13在進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于早期胃癌、癌前病變和正常胃黏膜上皮組織(P均<0.05)；早期胃癌和癌前病變組織均顯著高于正常胃黏膜上皮組織(P<0.05)，此兩組間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1、圖2)。

二、BRD4、MMP-13表達(dá)與進(jìn)展期胃癌臨床病理特征的關(guān)系

兩組間比較，*P<0.05，****P<0.000 1，ns P>0.05

兩組間比較，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1, ns P>0.05

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，BRD4表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者的飲酒史和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，而MMP-13表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者的各項(xiàng)臨床病理參數(shù)均無(wú)明顯相關(guān)性(表1)。

表1 BRD4、MMP-13表達(dá)與進(jìn)展期胃癌臨床病理特征的關(guān)系

三、進(jìn)展期胃癌組織中BRD4、MMP-13表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，進(jìn)展期胃癌組織中的BRD4與MMP-13表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.258,P=0.019)。

四、BRD4、MMP-13表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，BRD4、MMP-13表達(dá)陽(yáng)性者預(yù)后均明顯差于表達(dá)陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019;P=0.033)(圖3)。

圖3BRD4、MMP-13表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的關(guān)系(Kaplan-Meier生存曲線)

Cox回歸模型多因素分析顯示，BRD4表達(dá)陽(yáng)性、腫瘤直徑≥5 cm和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，MMP-13則無(wú)預(yù)后意義(表2)。

討 論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多種基因、多個(gè)步驟的復(fù)雜過(guò)程[9]，包括癌基因激活、抑癌基因失活等，這些生物學(xué)改變可致細(xì)胞增殖失控、發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。BRD4是BET家族的重要成員，近年來(lái)關(guān)于其在惡性腫瘤中表達(dá)的研究較多。Zuber等[1]通過(guò)在急性髓性白血病(AML)小鼠模型中對(duì)針對(duì)已知染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的shRNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)BRD4對(duì)于AML的維持起關(guān)鍵作用，BRD4 shRNA和BRD4小分子抑制劑JQ1在體內(nèi)、外均顯示出穩(wěn)定的抗白血病作用。在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中，抑制BRD4亦被證明能有效抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展[2-6]。BRD4在胃癌中的作用則尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

表2 進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后相關(guān)因素多因素分析(Cox回歸模型)

本研究結(jié)果顯示，進(jìn)展期胃癌組織中的BRD4表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜上皮、 癌前病變和早期胃癌組織，其中早期胃癌和癌前病變組織又顯著高于正常胃黏膜上皮組織，提示BRD4可能對(duì)胃癌發(fā)生起促進(jìn)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，BRD4表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者的飲酒史和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但與腫瘤大小、TNM分期等其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，BRD4表達(dá)陽(yáng)性者預(yù)后顯著差于表達(dá)陰性者。Cox多因素回歸分析顯示，BRD4表達(dá)陽(yáng)性是影響進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果提示，胃癌組織中高表達(dá)的BRD4可能通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)胃癌惡性進(jìn)展，導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良。

MMP-13在多種惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，可提高腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力[10]。本課題組相關(guān)研究亦表明MMP-13抑制劑可在體外抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲(暫未發(fā)表)。本研究結(jié)果證實(shí)，進(jìn)展期胃癌組織中的MMP-13表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜上皮、癌前病變和早期胃癌組織，早期胃癌和癌前病變組織又顯著高于正常胃黏膜上皮組織；進(jìn)展期胃癌組織中的BRD4與MMP-13表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，兩者均與進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)。上述數(shù)據(jù)提示，胃癌組織中高表達(dá)的BRD4可能通過(guò)調(diào)控MMP-13信號(hào)通路促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展，影響患者預(yù)后，但此假設(shè)需體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，BRD4是胃癌發(fā)生、發(fā)展中的重要基因，可能通過(guò)調(diào)控MMP-13影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后。這一發(fā)現(xiàn)為胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究和尋找新的胃癌治療靶點(diǎn)提供了線索。