林 琪， 金 濤， 羅睿林， 金發(fā)明， 張琦弦，姚 開， 何 強， 遲原龍,

(1. 四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院 健康食品科學(xué)評價研究中心，四川 成都 610065; 2. 綿竹市土門食品廠，四川 德陽 618200;3. 成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610041)

0 引 言

焦糖色是食用色素中用量最大、使用范圍最廣的天然食品添加劑之一，它可以顯著提升食品的色澤和風(fēng)味等感官品質(zhì)，主要應(yīng)用于調(diào)味品、飲料、糖果中[1]。焦糖色的生產(chǎn)方法主要為普通法和亞硫酸銨法，兩種方法均是以碳水化合物為原料，通過加熱制得焦糖色。二者的主要區(qū)別在于，亞硫酸銨法需要使用亞硫酸銨作為催化劑。普通法下糖類原料發(fā)生焦糖化反應(yīng)的程度較低，在形成焦糖色的同時也會生成較豐富的醛、酮等揮發(fā)性化合物。亞硫酸銨法下糖類原料發(fā)生焦糖化反應(yīng)的程度較高，糖裂解形成的小分子物質(zhì)在亞硫酸銨催化下會生成更加深色的化合物[2]。另外，焦糖色生產(chǎn)過程中，氨(銨)類化合物可能反應(yīng)生成危害物質(zhì)4-甲基咪唑[2-3]，國家標(biāo)準(zhǔn)限定焦糖色中4-甲基咪唑的含量不得超過200 mg/kg[4]。因此，有研究主要致力于通過改進原料和工藝，以制得不含或者僅含低量4-甲基咪唑的焦糖色[5]。

不同生產(chǎn)方法下制得焦糖色的特征風(fēng)味成分以及4-甲基咪唑含量可能存在較大差異[6-7]。已有研究中，Paravisini等[8]發(fā)現(xiàn)焦糖色的特征風(fēng)味物質(zhì)為辛醛和2,4-二羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮，主要表現(xiàn)為甜味、堅果味、烘烤味。楊偉等[9]發(fā)現(xiàn)濃縮對焦糖色的風(fēng)味物質(zhì)具有較大影響，雜環(huán)類化合物是焦糖色的主體風(fēng)味物質(zhì)。黃志勤[10]和翟文靜[11]分別采用分光光度法及液質(zhì)聯(lián)用法對焦糖色中的4-甲基咪唑進行了測定。盡管如此，不同生產(chǎn)方法對焦糖色特征風(fēng)味成分和4-甲基咪唑的影響卻鮮有報道。

對普通法和亞硫酸銨法制得的焦糖色中的特征風(fēng)味成分和4-甲基咪唑進行分析，不僅可為它們的風(fēng)味特征和風(fēng)味差異提供數(shù)據(jù)支撐，還可判定焦糖色的安全性，從而為制得具有較佳風(fēng)味且僅含低量或不含4-甲基咪唑的焦糖色生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本文采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)法檢測普通法和亞硫酸銨法焦糖色中揮發(fā)性成分的種類和含量，并探討兩種焦糖色特征風(fēng)味的差異。采用高效液相色譜(HPLC)法測定兩種焦糖色的4-甲基咪唑含量。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

普通法和亞硫酸銨法焦糖色由四川省德陽市某焦糖色生產(chǎn)廠家提供。4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：822-36-6)購于上海sigma公司；3-辛醇、甲醇、三氯甲烷為色譜純試劑；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相萃取頭，美國Supelco公司；QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司；LC-16型高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；722S分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 焦糖色揮發(fā)性成分的檢測

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)，以3-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物[12]，對焦糖色的揮發(fā)性化合物進行定性和半定量分析。

以甲醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度為135 mg/L的3-辛醇內(nèi)標(biāo)液。采用NIST14s譜庫檢索，結(jié)合保留指數(shù)及相關(guān)文獻進行人工譜圖解析，確定兩種焦糖色的揮發(fā)性成分。采用焦糖色各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積對比，進行半定量分析[13]，計算公式為

式中：Cd——焦糖色揮發(fā)性成分測定量，μg/kg；

A1——焦糖色揮發(fā)性成分峰面積；

A2——內(nèi)標(biāo)物峰面積；

m1——樣品質(zhì)量，g；

C2——內(nèi)標(biāo)液質(zhì)量濃度，mg/L；

V2——內(nèi)標(biāo)液添加體積，μL。

SPME條件：取5 g焦糖色樣品于20 mL頂空瓶中，加入1 g氯化鈉和2 μL 3-辛醇內(nèi)標(biāo)工作液，在40℃下用固相萃取頭萃取焦糖色揮發(fā)性化合物30 min。

GC-MS條件：SH-Rxi-5silMS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度240 ℃，解析時間5 min。起始溫度40 ℃，2 ℃/min升溫至120 ℃，再12 ℃/min升溫至240 ℃[9]。

1.3 焦糖色揮發(fā)性風(fēng)味成分的確定

通過查閱相關(guān)文獻及書籍[14-18]確定具有風(fēng)味的揮發(fā)性物質(zhì)為焦糖色揮發(fā)性風(fēng)味成分，并將揮發(fā)性風(fēng)味成分含量在20 μg/kg以上的物質(zhì)確定為特征風(fēng)味物質(zhì)。

1.4 焦糖色中4-甲基咪唑的檢測

對焦糖色中的4-甲基咪唑進行萃取，再采用高效液相色譜儀(HPLC)，以4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品為對照物，對萃取得到的4-甲基咪唑進行定性和定量分析。

精確稱取4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用去離子水定容至100 mL，得到4-甲基咪唑質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別取該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.10，1.00，2.00，4.00，10.0 mL，用去離子水定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.10，1.00，2.00，4.00 ，10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用HPLC檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄4-甲基咪唑的保留時間，并以4-甲基咪唑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

萃取條件：取1 g焦糖色樣品于250 mL分液漏斗中，依次加入5 mL 100 g/L碳酸鈉溶液、16 mL三氯甲烷和4 mL乙醇，振蕩萃取5 min，靜置分層后收集有機相。采用相同方法對水相進行二次萃取，合并兩次萃取相。經(jīng)清洗、脫水、減壓濃縮后，以去離子水定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，HPLC檢測4-甲基咪唑的含量[19]。

HPLC條件：Inertsil ODS-3色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為0.05%氨水和乙腈(體積比為1:4)，流量0.8 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

1.5 焦糖色內(nèi)含物質(zhì)校正含量的換算

焦糖色添加劑一般呈液態(tài)，不同生產(chǎn)方法，甚至不同批次的焦糖色可能存在濃度差異。為了使其中的物質(zhì)含量具備可比性，需要將不同焦糖色的濃度換算到同一基準(zhǔn)濃度。為此，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，焦糖色中的物質(zhì)含量需換算為焦糖色基準(zhǔn)濃度時的含量[4]。所以，按照國標(biāo)方法，首先測定焦糖色在610 nm下的吸光度與濃度的比值E，再將1.2、1.3和1.4中檢測得到的揮發(fā)性成分、揮發(fā)性風(fēng)味成分和4-甲基咪唑含量換算為E為0.1時的含量值，即為校正含量[4]。

E的測定：精確稱取約0.5 g焦糖色，用去離子水溶解并定容至500 mL，并用分光光度儀在610 nm處測定其吸光度(吸光度控制在0.2～0.8之間，否則應(yīng)調(diào)整焦糖色濃度，再重新測定吸光度)。按下式計算E：

式中：A——焦糖色溶液的吸光度；

C——焦糖色溶液的濃度，g/L。

按下式進行校正含量換算：

式中：Cc——校正含量，μg/kg或mg/kg；

Cd——檢測含量，μg/kg或mg/kg。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2013對樣品中揮發(fā)性化合物種類及含量進行統(tǒng)計分析，采用Origin 9.0進行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 焦糖色中揮發(fā)性成分分析

普通法和亞硫酸銨法焦糖色中含有8類揮發(fā)性成分，分別為呋喃、醇、酸、酮、烴、吡咯、醛和其他，它們的含量和數(shù)量見表1?？梢钥闯?，普通法焦糖色中揮發(fā)性成分總含量(663 μg/kg)和數(shù)量(35種)均明顯高于亞硫酸銨法焦糖色中揮發(fā)性成分總含量(175 μg/kg)和數(shù)量(25種)，表明普通法焦糖色中含有更豐富的揮發(fā)性物質(zhì)。在各類揮發(fā)性成分中，呋喃、醇、醛和酮類是兩種焦糖色中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，它們含量和數(shù)量分別占總揮發(fā)性成分的80%和60%以上，這與Laurianne Paravisini等[8,20]發(fā)現(xiàn)焦糖色主要風(fēng)味物質(zhì)為雜環(huán)、碳環(huán)和酸類化合物的結(jié)果相似。

表1 普通法和亞硫酸銨法焦糖色中8類揮發(fā)性成分的含量和數(shù)量

2.2 焦糖色中風(fēng)味成分分析

普通法和亞硫酸銨法焦糖色中分別含有12種和13種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其化合物種類、特征風(fēng)味和含量見表2。普通法焦糖色中風(fēng)味成分總含量(493 μg/kg)遠(yuǎn)高于亞硫酸銨法焦糖色中風(fēng)味成分總含量(164 μg/kg)，表明普通法焦糖色具有更好的風(fēng)味。將含量高于20 μg/kg的化合物作為焦糖色中特征風(fēng)味成分，則普通法焦糖色特征風(fēng)味成分為乙酸、糠醇、2-乙酰呋喃、2-吡咯甲醛、5-甲基糠醛和N-糠基吡咯(見圖1（a）)；亞硫酸銨法焦糖色為糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、2-吡咯甲醛和呋喃酮(見圖1（b）)，所以兩種焦糖色均表現(xiàn)出咖啡、麥芽、焙烤、杏仁、甜香和焦糖等特征風(fēng)味，且普通法焦糖色的這種特征風(fēng)味更強。由于亞硫酸銨法焦糖色在加工過程中添加銨鹽和亞硫酸鹽作為催化劑，碳水化合物原料的美拉德和焦糖化反應(yīng)的方向與程度會與普通法工藝不同，因此兩種焦糖色的特征風(fēng)味會存在差異[2]。此外，焦糖色中一些含量較低的物質(zhì)，如5-羥甲基糠醛和甲基糠基二硫，由于具有較低的閾值，也對焦糖色的風(fēng)味產(chǎn)生影響[14]。

表2 普通法和亞硫酸銨法焦糖色中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類和含量1）

圖1 普通法焦糖色和亞硫酸銨法焦糖色中特征風(fēng)味物質(zhì)的氣相色譜圖

2.3 焦糖色中4-甲基咪唑含量分析

4-甲基咪唑在HPLC上的保留時間為5.288 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=451.18x–25.34，線性范圍為0.1～10 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，該方法可以準(zhǔn)確測定樣品中4-甲基咪唑的含量。經(jīng)過HPLC測定和校正含量換算，普通法和亞硫酸銨法焦糖色中4-甲基咪唑的含量分別為1.49 mg/kg和1.75 mg/kg，遠(yuǎn)低于焦糖色中4-甲基咪唑的國家限量標(biāo)準(zhǔn)(200 mg/kg)，表明這兩種焦糖色具有較好的安全性。

3 結(jié)束語

本文通過研究發(fā)現(xiàn)，普通法焦糖色比亞硫酸銨法焦糖色具有更優(yōu)的風(fēng)味。普通法焦糖色的特征風(fēng)味成分為糠醇、2-乙酰呋喃、2-吡咯甲醛、N-糠基吡咯、5-甲基糠醛和乙酸；亞硫酸銨法焦糖色為5-甲基糠醛、糠醇、2-吡咯甲醛、2-乙酰呋喃和呋喃酮，均表現(xiàn)出咖啡、麥芽、焙烤、杏仁、甜香和焦糖等特征風(fēng)味，且普通法焦糖色的特征風(fēng)味更強。兩種焦糖色中4-甲基咪唑含量均遠(yuǎn)低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)，具有較好的安全性。