劉輝 鄭超紅 何藝梅 朱國嬋 梁倩文

茂名出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合實(shí)驗(yàn)室廣東茂名525000

生物體(果實(shí))或其代謝產(chǎn)物，或者通過仿生合成，針對農(nóng)業(yè)有害生物進(jìn)行殺滅或抑制的制劑[1]。此類制劑多為強(qiáng)極性物質(zhì)，具有低毒、無公害、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)?？煞譃橹参镌础游镌春臀⑸镌慈箢愋蚚2-5]，目前在果蔬害蟲防治方面得到廣泛應(yīng)用。但針對市面上常見的:印楝素、苦參堿、氧化苦參堿、煙堿、魚藤酮等生物農(nóng)藥國家尚未制定殘留限量檢測標(biāo)準(zhǔn)，也沒有標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。近年國外一些研究表明，印楝素具有遺傳毒性，可引起人類精子畸形從而影響性功能和生育能力；苦參堿具有神經(jīng)毒性，可影響人類的造血系統(tǒng)、肝臟、腎臟；魚藤酮可能會誘發(fā)帕金森病等[6-10]。因此亟需建立一種生物農(nóng)藥多殘留檢測方法，并監(jiān)控其殘留水平。目前針對生物農(nóng)藥的檢測方法主要有ELISA法、分光光度法、生物電極法、氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[11-27]。本項(xiàng)目組利用全自動固相萃取－液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法首次建立了水果、蔬菜中印楝素、苦參堿、氧化苦參堿、煙堿、魚藤酮、藜蘆堿和井崗霉素7種生物農(nóng)藥的多殘留檢測方法，為生物農(nóng)藥的殘留檢測和監(jiān)控提供了重要支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

儀器:Waters Quattro Premier XEUPLC-MS/MS，北京優(yōu)興全自動固相萃取儀；BUCHI平行蒸發(fā)儀；IKA渦旋振蕩器；科導(dǎo)超聲儀；Sigma 3-18K高速離心機(jī)。試劑:甲醇(Fisher，色譜純)，乙腈(Fisher，色譜純)，甲酸(FA)(Fisher，色譜純)，氨水(GR)，乙酸(HA)(GR)。生物農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(北京壇墨質(zhì)檢):苦參堿、煙堿、魚藤酮、氧化苦參堿、印楝素、黎蘆堿、井崗霉素。Waters MCX固相萃取小柱(60 mg，3 mL)。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱:Waters HILIC 1.7 μm，2.1×100 mm，柱溫:40℃，進(jìn)樣體積:10 μL。

流動相:A 5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸(FA))，B乙腈。

表1 流動相梯度表

1.2.2 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓:1.0 KV，源溫:120℃，脫溶劑溫度:350℃，脫溶劑氣流速:800(L/h)。

采集方式:ES(+)，MRM方式，各種物質(zhì)的離子對信息見表2。

表2 離子對信息[28-29]

1.3 測定方法

1.3.1 樣品制備

稱取5.0g樣品，加入20mL2%乙酸(HA)溶液，渦旋混合，超聲提取10min，離心，上清液全部轉(zhuǎn)移至25mL比色管中，然后用2%HA定容至25mL，取5mL定容液上全自動固相萃取儀過MCX小柱按1.3.2程序進(jìn)行凈化。

1.3.2 全自動固相萃取程序

收集洗脫液，蒸干，用流動相初始梯度定容至1 mL，過0.20 μm微孔濾膜后上機(jī)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

本項(xiàng)目研究的生物農(nóng)藥在結(jié)構(gòu)上多具有仲胺、叔胺基或醇羥基等極性基團(tuán)[30]。項(xiàng)目組比較了非極性柱(Waters BEH C18)、中等極性柱(Waters BEH T3)和強(qiáng)極性柱(Waters BEH HILIC)3種色譜柱對7種新型生物農(nóng)藥的分離效果。發(fā)現(xiàn)在C18柱上除魚藤酮和印楝素有保留外，其他5種物質(zhì)均沒有保留；在T3柱上除井崗霉素沒有保留外，其他6種物質(zhì)均有保留，但個(gè)別組分峰形較胖；在HILIC柱上7種物質(zhì)均有保留，且有比較好的峰形。所以最終選擇HILIC柱作為分析柱。

2.2 固相萃取機(jī)理及小柱的選擇

2.2.1 反相萃取模式

在反相萃取模式下，我們選擇了Waters的HLB，Agilent的Plexa、PPL、Focus、ENV和DIKMA的C8 6種非極性固相萃取小柱作為吸附柱，用濃度為50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品考察了7種生物農(nóng)藥在酸性(pH=4)、中性(pH=7.0)和堿性(pH=9.0)條件下6種小柱對7種生物農(nóng)藥的保留情況(洗脫液為甲醇)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種條件下6種小柱對井崗霉素都沒有保留，不能滿足方法的要求，但除井崗霉素外，在中性或堿性條件下HLB、Plexa、Focus和ENV這4種小柱對其他物質(zhì)均有不錯(cuò)的保留。

2.2.2 離子萃取模式

在離子模式下，我們選擇了Agilent的強(qiáng)陽離子交換柱PCX、弱離子交換柱CBA和DIKMA的C8/SCX混合型非極性強(qiáng)陽離子交換柱，用濃度為50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品考察了7種生物農(nóng)藥在2%HA、2%FA、1%鹽酸(HCL)、1%磷酸(H3PO4)、1%三氯乙酸、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(MC)(pH=4.0)6種溶液體系中7種生物農(nóng)藥的保留情況(洗脫液為5%氨化甲醇)(圖1～圖3)。

圖1 PCX小柱6種溶液中7種農(nóng)藥回收柱圖

圖2 CBA小柱6種溶液中7種農(nóng)藥回收柱圖

圖3 C8/SCX小柱6種溶液中7種農(nóng)藥回收柱圖

從圖1～圖3可以看出，CBA小柱在6種溶液下對7種農(nóng)藥大部分都沒有比較好的保留；PCX和C8/SCX小柱效果相當(dāng)，在2%HA和2%FA溶液中對7種農(nóng)藥都有比較好的保留，可以作為方法的備選模式和柱子。

2.2.3 正相萃取模式

在正相模式下，我們選擇了NH4、PSA、FLORISI、Prime HLB、NH4/Carb、Carb等6種極性吸附小柱，用濃度為50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品考察了80%乙腈-水和乙腈兩種溶液體系中7種生物農(nóng)藥在6種小柱中的保留情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除Prime HLB在80%乙腈-水體系中對7種生物農(nóng)藥有比較好的保留外，其他柱子和體系對井崗霉素都沒有保留。這可能與井崗霉素的結(jié)構(gòu)含有大量的醇羥基，極性極大無法洗脫有關(guān)。

2.3 樣品前處理方式的最終確定

根據(jù)前面的試驗(yàn)，PCX、C8/SCX、PrimeHLB 3種小柱可以作為方法優(yōu)化小柱，2%HA、2%FA、80%乙腈-水3種溶液體系可作為前處理溶液。項(xiàng)目組選用小白菜為測試對像，采用加標(biāo)回收方式進(jìn)行考察，加標(biāo)濃度為100 ng/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%乙腈-水體系下PrimeHLB小柱處理后，無法去除樣品中的色素，定容后顏色比較深，干擾測定；2%FA溶液處理樣品后，提取液比較渾濁，不利于過柱；2%HA溶液處理后，提取液比較清晰、透明，過PCX柱處理后，樣品比較干凈，回收率介于80%～108%間，比較理想。所以最終選定2%HA作為提取液，PCX小柱為前處理柱。

2.4 方法檢出限與線性范圍

取空白樣品6份，按1.3.1制備后合并定容液，得到基質(zhì)校準(zhǔn)液。用基質(zhì)校準(zhǔn)液稀釋成以下標(biāo)準(zhǔn)系列:0、10、20、50、100、200 ng/mL，并上機(jī)測試。7種被測生物農(nóng)藥檢出限均≤0.010 mg/kg，線性范圍介于0～200 ng/mL，回歸方程和相關(guān)系數(shù)詳見表3。

表3 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

圖4 10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖

圖5 0.010 mg/kg加標(biāo)樣品煙堿離子通道的信噪比(S/N＞10)

2.5 方法精密度

取6份空白的荔枝樣品，制備成50 μg/kg的加標(biāo)樣品，然后上機(jī)測試，RSD介于2.3%～7.1%間，說明方法精密度良好(表4)。

表4 精密度試驗(yàn)(n=6)

2.6 方法準(zhǔn)確度與回收率

取空白荔枝、龍眼、芥菜為基質(zhì)樣品，每種基質(zhì)樣品分別制備10 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg 3個(gè)濃度加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度制備6份加標(biāo)樣品，上機(jī)測試。結(jié)果加標(biāo)回收率介于80%～111.7%間，RSD介于1.1%～14.7%間，說明方法具有較好的準(zhǔn)確度(表5)。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)

2.7 樣品檢測

自該方法建立以來，成功應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部300多批各種水果、蔬菜樣品的檢測，并多次檢出生物農(nóng)藥煙堿殘留，檢測結(jié)果介于0.062～1.41 mg/kg間。

圖6 檢出煙堿殘留(0.62 mg/kg)的蔬菜樣品總離子流圖

3 結(jié)論

本項(xiàng)目研究建立的水果蔬菜中7種新型生物農(nóng)藥殘留全自動固相萃取—液質(zhì)聯(lián)用檢測方法為果蔬中生物農(nóng)藥殘留的檢測提供了重要支持，為保證食品安全提供了重要保障，值得推廣和應(yīng)用。本檢測方法可以配合國家相關(guān)部門開展生物農(nóng)藥殘留監(jiān)測的研究并制定相關(guān)生物農(nóng)藥殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)。