劉 志 孫皓然 吳學(xué)壯 張鐵濤 郭俊剛 崔 虎 王中成 乜 豪 邢秀梅 楊福合 高秀華*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130123；3.安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，蚌埠 233003)

銅是動物必需的微量元素之一，具有維持鐵的正常代謝、促進骨骼的發(fā)育、參與細胞內(nèi)能量代謝等諸多生理作用，動物長期缺銅會導(dǎo)致生長受阻、骨骼發(fā)育異常以及共濟失調(diào)等癥狀，嚴重影響動物的生長性能和經(jīng)濟價值[1]。目前硫酸銅(CuSO4)是配制動物飼糧時最常用到的銅源，具有補銅效果良好、價格便宜、容易獲得等特點，因此在生產(chǎn)中廣泛使用。此外在斷奶仔豬上研究表明，飼糧中添加一定水平(125～250 mg/kg)的硫酸銅對于仔豬有顯著的促進生長作用[2]。前期對育成期藍狐的研究表明，飼糧中銅水平為40 mg/kg(銅源為硫酸銅)時可提高育成期藍狐的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率[3]。然而硫酸銅在實際使用過程仍存在許多問題，研究表明動物對無機銅的利用率較低，飼糧中大部分的硫酸銅并未被機體利用，經(jīng)由糞便排出體外，這不僅造成銅的浪費，更會對環(huán)境產(chǎn)生重金屬污染[4]。此外，高銅會降低飼糧中其他金屬元素如鋅、鐵的吸收，加速飼糧中的抗氧化物質(zhì)和油脂的氧化變質(zhì)[5]。有機銅具有生物學(xué)利用率高、適口性好、礦物質(zhì)元素間拮抗小、對飼料中的還原性物質(zhì)破壞小等特點[6]，使用有機銅替代硫酸銅可有效提高銅的利用率，降低銅的排放，在環(huán)保壓力日益增大的背景下，有機銅的優(yōu)勢更加明顯，因此有機銅已經(jīng)逐漸被越來越多飼料生產(chǎn)者認可和采用。蛋氨酸銅(Met-Cu)是蛋氨酸與銅的螯合產(chǎn)物，可以通過氨基酸胞飲的方式被機體吸收，緩解微量元素之間競爭性拮抗作用，大大提高銅離子的吸收利用率，并能夠降低銅對飼料中還原性物質(zhì)如維生素C、硒等的破壞和油脂的氧化酸敗[7]。鄧伏清等[8]將蛋氨酸銅與硫酸銅的效果進行比較發(fā)現(xiàn)，仔豬對蛋氨酸銅的利用率較高。吳學(xué)壯[9]比較了水貂對硫酸銅、蛋氨酸銅和堿式氯化銅3種銅源的生物學(xué)利用率，結(jié)果表明育成期階段蛋氨酸銅相較于硫酸銅的生物學(xué)利用率為124.35%。目前不同銅源生物學(xué)利用率的研究主要集中在豬和禽類，藍狐對有機銅的利用情況尚未開展系統(tǒng)研究。因此，本試驗以蛋氨酸銅作為有機銅的代表，研究蛋氨酸銅和硫酸銅對育成期藍狐生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率及血清指標的影響，為有機銅在藍狐生產(chǎn)實踐科學(xué)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼糧

鑒于藍狐目前還沒有統(tǒng)一的營養(yǎng)需要量標準，本研究參照NRC[10]藍狐營養(yǎng)需要量標準及近年來國內(nèi)外藍狐營養(yǎng)的相關(guān)文獻報道[11-13]，設(shè)計出育成期藍狐的基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。經(jīng)實測基礎(chǔ)飼糧銅含量為14.44 mg/kg干物質(zhì)(DM)。試驗飼糧由基礎(chǔ)飼糧額外添加0、50、100 mg/kg(以銅計)的五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)或蛋氨酸銅配制而成。由于蛋氨酸銅在添加銅的同時會引入不同劑量的蛋氨酸，這會導(dǎo)致各組試驗飼糧蛋氨酸含量出現(xiàn)差異，因此本試驗以“蛋氨酸銅最高組”中引入的蛋氨酸量為基準，其他各組中補充額外的蛋氨酸到此水平，以維持各組試驗飼糧蛋氨酸水平一致性。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)每千克預(yù)混料含有 Contained the following per kg of the premix：VA 1 000 000 IU，VD3200 000 IU，VE 6 000 IU，VB16 00 mg，VB2800 mg，VB610 mg，VK3100 mg，VC 40 000 mg，煙酸 niacin acid 4 000 mg，泛酸 pantothenic acid 80 mg，膽堿 choline 30 000 mg，F(xiàn)e 8 200 mg，Mn 1 200 mg，I 50 mg，Se 20 mg，Co 50 mg。
2)粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣、銅、鋅、總磷為測定值，其他為計算值。CP, EE, Ca, Cu, Zn and TP were measured values, while the others were calculated values.

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗選擇 (55±5)日齡健康藍狐100只，隨機分成5個組，每個組20個重復(fù)(公母各10只)，每個重復(fù)1只藍狐。5組藍狐分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0、50或100 mg/kg的五水硫酸銅或蛋氨酸銅的試驗飼糧，2種銅源共用0添加組為對照組。預(yù)試期為7 d，正試期為60 d。試驗藍狐均為單籠(105 cm×80 cm×70 cm)飼養(yǎng)，試驗開始前，對藍狐進行常規(guī)免疫接種，每日08:00與15:00各飼喂1次，自由采食，自由飲水，每日記錄實際采食量。

1.3 消化代謝試驗

正式試驗期開始后30 d，每組隨機挑選8只健康藍狐進行為期5 d的消化代謝試驗。試驗采用全收糞法，采用糞尿可分離式接糞盤收集藍狐每日的糞便及尿液。代謝試驗期間飼養(yǎng)管理與日常飼養(yǎng)管理完全相同。每天收集飼料樣品、糞便和尿液并詳細記錄每只藍狐的采食量與剩料量，糞便稱重后按鮮重的5%加入10%的硫酸溶液，并加入少量甲苯防腐，于-20 ℃保存?zhèn)溆?；尿液按?00 mL加入10 mL 10%硫酸溶液，滴加4滴甲苯防腐，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能

試驗正試期開始第1天早晨對藍狐進行空腹稱重，為試驗動物的初重，以后每隔15 d稱重1次，記錄藍狐的體重，并計算出藍狐的平均日增重和料重比。記錄每只藍狐每天的給料量和剩料量，計算藍狐的平均日采食量。

1.4.2 營養(yǎng)物質(zhì)消化率

飼糧及糞便中的干物質(zhì)含量采用65 ℃烘干法測定，參照GB/T 6435—2006；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定，參照GB/T 6432—1994；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，參照GB/T 6433—2006。采用火焰原子吸收法(GB/T 13885—2003)測定飼糧、肝臟及排泄物中銅的含量。

干物質(zhì)消化率(%)=[(干物質(zhì)采食量-干物質(zhì)排出量)/干物質(zhì)采食量]×100；粗蛋白質(zhì)消化率(%)=[(粗蛋白質(zhì)攝入量-糞中粗蛋白質(zhì)含量)/粗蛋白質(zhì)攝入量]×100；粗脂肪消化率(%)=[(粗脂肪攝入量-糞中粗脂肪含量)/粗脂肪攝入量]×100；氮沉積(g/d)=食入氮-糞氮-尿氮。

1.4.3 血清指標

采用日立7020型全自動生化分析儀測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(UN)、銅(Cu)、鐵(Fe)含量及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性，試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司，測定過程嚴格參照試劑盒說明書。采用紫外/可見光分光光度計(德國耶拿)測定血清銅藍蛋白(Cp)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)活性，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測定過程嚴格參照試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SAS 9.1.3軟件GLM程序進行數(shù)據(jù)分析，以銅源、銅水平以及銅源及銅水平的互作效應(yīng)進行2×3雙因素方差分析(two-way ANOVA)。模型如下：

Yijk=μ+Ai+Bj+(AB)ij+εijk。

式中：Yijk是觀測值；μ是平均值；Ai是銅源的主效應(yīng)；Bj是銅水平的主效應(yīng)；(AB)ij是銅源與銅水平的交互作用；εijk是隨機誤差。對差異顯著主效應(yīng)進行Duncan氏法多重比較，檢驗差異顯著性，銅源及銅水平互作效應(yīng)顯著時采用LSMEANS程序PDIFF方法進行顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同銅源及銅水平對育成期藍狐生長性能的影響

不同銅源及銅水平對育成期藍狐生長性能的影響見表2。由表可知，飼糧銅水平對育成期藍狐平均日增重有極顯著影響(P<0.01)，50、100 mg/kg銅添加組平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)；飼糧銅水平對育成期藍狐料重比有顯著影響(P<0.05)，50、100 mg/kg銅添加組料重比顯著低于對照組(P<0.05)。飼糧銅源對育成期藍狐平均日采食量、平均日增重和料重比均無顯著影響(P>0.05)。各組育成期藍狐的平均日采食量、平均日增重和料重比均未觀測到銅源及銅水平的互作效應(yīng)(P>0.05)。

表2 不同銅源及銅水平對育成期藍狐生長性能的影響Table 2 Effects of different Cu sources and levels on growth performance of growing blue foxes

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 不同銅源及銅水平對育成期藍狐營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

不同銅源及銅水平對育成期藍狐營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響見表3。由表可知，飼糧銅水平對育成期藍狐粗蛋白質(zhì)消化率和糞銅含量有極顯著影響(P<0.01)，對干物質(zhì)消化率、粗脂肪消化率有顯著影響(P<0.05)，100 mg/kg銅添加組干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率顯著高于對照組(P<0.05)，50、100 mg/kg銅添加組粗脂肪消化率、糞銅含量顯著高于對照組(P<0.05)。飼糧銅源對育成期藍狐糞銅含量有顯著影響(P<0.05)，蛋氨酸銅組的糞銅含量顯著低于硫酸銅組(P<0.05)；飼糧銅源對育成期藍狐干物質(zhì)消化率、粗脂肪消化率、粗蛋白質(zhì)消化率和氮沉積均無顯著影響(P>0.05)。各組育成期藍狐的干物質(zhì)消化率、粗脂肪消化率、粗蛋白質(zhì)消化率、氮沉積和糞銅含量均未觀測到銅源與銅水平的互作效應(yīng)(P>0.05)。

2.3 不同銅源及銅水平對育成期藍狐血清指標的影響

不同銅源及銅水平對育成期藍狐血清指標的影響見表4和表5。由表4可知，飼糧銅水平對育成期藍狐血清UN含量有極顯著影響(P<0.01)，50、100 mg/kg銅添加組的血清UN含量極顯著高于對照組(P<0.01)。飼糧銅源對育成期藍狐血清UN含量有極顯著影響(P<0.01)，蛋氨酸銅組的血清UN含量極顯著高于硫酸銅組(P<0.01)。飼糧銅源及銅水平對育成期藍狐血清TP、ALB、GLO、Cu、Fe含量及ALT、AST活性均無顯著影響(P>0.05)。各組育成期藍狐的血清TP、ALB、GLO、UN、Cu、Fe含量及ALT、AST活性均未觀測到銅源與銅水平的互作效應(yīng)(P>0.05)。

由表5可知，飼糧銅源及銅水平對育成期藍狐血清Cp和Cu-Zn SOD活性均無顯著影響(P>0.05)。各組育成期藍狐的血清Cp和Cu-Zn SOD活性均未觀測到銅源與銅水平的互作效應(yīng)(P>0.05)。

表3 不同銅源及銅水平對育成期藍狐營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響Table 3 Effects of different Cu sources and levels on nutrient digestibility of growing blue foxes

表4 銅源及銅水平對育成期藍狐血清生化指標的影響Table 4 Effects of different Cu sources and levels on serum biochemical indices of growing blue foxes

續(xù)表4項目Items丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT/(U/L)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST/(U/L)總蛋白TP/(g/L)白蛋白ALB/(g/L)球蛋白GLO/(g/L)尿素氮UN/(mmol/L)銅Cu/(μmol/L)鐵Fe/(μmol/L)P值P-value銅源 Cu source0.770.290.540.870.22<0.010.510.69銅水平 Cu level0.560.570.180.090.11<0.010.820.08銅源×銅水平 Cu source×Cu level0.920.750.630.610.570.130.740.11

表5 銅源及銅水平對育成期藍狐血清Cp和Cu-Zn SOD活性的影響Table 5 Effects of different Cu sources and levels on activities of Cp and Cu-Zn SOD in serum of growing blue foxes

3 討 論

3.1 不同銅源及銅水平對育成期藍狐生長性能的影響

研究表明，飼糧中添加適量銅對幼齡單胃動物如斷奶仔豬等有明顯的促生長效果。在本試驗中，飼糧中添加外源銅提高了育成期藍狐的生長性能，這與劉志等[3]對育成藍狐的研究結(jié)果一致。白玉妍等[14]對烏蘇里貉的研究表明，飼糧中使用蛋氨酸銅作為銅源能夠提高貉的生長速度，增加體長。李道林[15]研究表明，高劑量銅(40～80 mg/kg)對獺兔有促生長效果，且添加蛋氨酸銅的效果明顯優(yōu)于硫酸銅。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同添加水平下蛋氨酸銅的促生長效果略好于硫酸銅，這與上述報道一致。氨基酸銅是氨基酸與銅的螯合反應(yīng)產(chǎn)物，它可以通過氨基酸胞飲的方式被機體吸收，緩解微量元素之間競爭性拮抗作用，提高銅離子的吸收利用率，并能夠降低銅離子對飼料中維生素的氧化破壞和油脂的酸敗。銅對藍狐的促生長機理目前尚不清楚，推測可能與消化酶活性的提高和生長相關(guān)激素分泌增多等有關(guān)。杜冰[16]研究表明，適宜的銅離子濃度能提高機體多種消化酶的活性，進而提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率。Luo等[17]的研究證明，高銅可以提高斷奶仔豬脂肪酶的活性。毛皮動物飼糧的一個重要特點是富含高油脂，因此銅對脂肪消化率的提升在藍狐飼糧所起的效果更加突出。羅緒剛等[18]報道，銅能通過促進垂體生長激素的基因表達而促進幼豬的生長，甘氨酸銅比硫酸銅更有效地提高了斷奶仔豬垂體生長激素mRNA的合成。高銅飼糧對育成期藍狐生長相關(guān)激素水平的影響目前尚不清楚，需要進一步研究驗證。

3.2 不同銅源及銅水平對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

研究表明，高劑量銅可以通過改善腸黏膜形態(tài)、提高消化酶活性以及改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)提高機體對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的利用[19]。Radecki等[20]研究表明，高銅可以通過使空腸變薄、十二指腸絨毛變短、減緩空腸等組織更新速度從而降低了它們維持的能量需要，相應(yīng)地增加了用于生產(chǎn)的能量。Shurson等[21]報道，飼糧中添加高銅能夠增加小腸隱窩的深度。Dove[22]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加高銅能夠顯著提高干物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。Luo等[17]進一步研究揭示了高銅對消化酶的影響，高銅能夠促進消化道內(nèi)腸脂肪酶和磷脂酶A的活性，此外銅的體外試驗還證實了高銅能夠提高胰脂肪酶的活性。吳學(xué)壯[9]報道飼糧中添加銅能夠促進水貂膽汁的分泌，飼糧中脂肪得到更充分的乳化，進而提高了飼糧脂肪的消化率。Kirchgessner等[23]報道，適宜的銅離子濃度可以激活胃蛋白酶原，提高胃蛋白酶活性，促進食物蛋白質(zhì)的分解和吸收。高銅能夠提高仔豬血液中胃泌素的水平，胃泌素能刺激鹽酸、胰液和膽汁的分泌，此外還能刺激主細胞分泌胃蛋白酶原，促進蛋白質(zhì)的消化。本研究中，隨著飼糧銅水平的升高，干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的消化率顯著提升，出現(xiàn)這種情況的原因可能是銅的添加提高了消化酶活性并改善了腸黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使得飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)更容易被吸收。Turnlund等[24]采用同位素失蹤法研究飼糧銅水平與機體吸收率的關(guān)系，結(jié)果表明隨著飼糧銅水平的升高，銅的吸收率逐漸降低。本研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂高銅飼糧的藍狐糞銅含量極顯著高于飼喂低銅飼糧的藍狐。蛋氨酸銅可以通過氨基酸的胞吞方式被機體吸收，因此機體蛋氨酸銅的吸收率要高于硫酸銅。在銅添加水平一致的情況下，添加蛋氨酸銅的藍狐糞銅含量更低。

3.3 不同銅源及銅水平對育成期藍狐血清生化指標的影響

血清ALT和AST是檢測人和動物肝功能的重要指標，研究表明高銅會造成動物肝臟損傷，肝細胞被破壞，致使血清AST和ALT活性升高[25-26]。本試驗表明，飼糧中添加100 mg kg硫酸銅或蛋氨酸銅形式的銅均為未引起藍狐肝臟的明顯損傷。血清蛋白是維持機體滲透壓和保持水平衡的重要物質(zhì)，主要由ALB和GLO組成。ALB在機體銅的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用，由腸道吸收進入門靜脈的銅離子會與先于血清中的ALB或組蛋白結(jié)合，經(jīng)血液循環(huán)最終到達肝臟。隨著飼糧銅水平的升高，被腸道吸收的銅離子會隨之增多，這就需要更多的ALB來負責(zé)轉(zhuǎn)運，這可能是血清ALB含量隨飼糧銅水平升高有升高趨勢的原因。李道林[15]研究發(fā)現(xiàn)，獺兔血清UN含量會隨著飼糧中銅水平的升高而降低，這與本試驗的結(jié)果并不一致，差異的來源可能是藍狐與獺兔不同的生理特性造成的。動物血漿中銅的含量受到的機體嚴格調(diào)控，然而當體內(nèi)銅的含量超過調(diào)控范圍后，血漿中銅的含量會明顯升高，嚴重時會產(chǎn)生高銅血癥[27]。銅可以提高鐵的利用，因此藍狐血清鐵的含量會隨著飼糧銅水平的升高有增大的趨勢。

3.4 不同銅源及銅水平對育成期藍狐血清Cp和Cu-Zn SOD活性的影響

Cu-Zn SOD和Cp是動物機體2種重要的含銅酶，在機體起至關(guān)重要的氧化作用，可以有效保護機體，抵御由自由基引起氧化應(yīng)激。Feng等[28]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧添加250 mg/kg硫酸銅和100 mg/kg蛋白銅能夠提高血清Cp的活性，此外添加100 mg/kg蛋白銅還能提高紅細胞內(nèi)Cu-Zn SOD的活性。吳學(xué)壯[9]對水貂的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加銅能夠提高血清Cp和Cu-Zn SOD的活性。本研究中，雖然血清Cu-Zn SOD的活性各組間差異不顯著，但是血清Cp的活性隨著飼糧銅水平的升高而升高，這與上述在水貂和豬上的研究一致。

4 結(jié) 論

在含14.44 mg/kg銅的育成期藍狐基礎(chǔ)飼糧中再添加50 mg/kg蛋氨酸銅或者硫酸銅形式的銅均能獲得較好的促生長效果;此外,蛋氨酸銅可以顯著降低糞銅的排放，是一種更高效、環(huán)保的銅源。