畢小娟 陳代文 余 冰 何 軍 毛湘冰 鄭 萍 黃志清 羅鈞秋 羅玉衡 虞 潔

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

黃曲霉毒素B1(AFB1)是一類毒性極強的霉菌毒素[1]。AFB1污染造成的飼料原料浪費和動物生產(chǎn)性能下降給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。動物采食被AFB1污染的飼糧后，80%黃曲霉毒素在胃腸道前端快速通過被動運輸被機體吸收，后轉(zhuǎn)入肝臟進行代謝，從而出現(xiàn)肝臟損傷、食欲降低以及生長性能下降等中毒現(xiàn)象[2]。腸道作為AFB1吸收的主要部位，毒素濃度遠高于其他部位，但是關(guān)于AFB1對胃腸道的影響研究知之甚少。腸道健康是人和動物健康的關(guān)鍵因素，AFB1降低動物生產(chǎn)力是否是通過損傷腸道健康來實現(xiàn)還有待研究。而目前關(guān)于AFB1研究所用材料多數(shù)采用自然霉變玉米，其中含有多種毒素可相互作用，不利于深入認識AFB1的毒性效應和機理。而對單一AFB1研究還較少，且所得結(jié)果差異較大。因此，本試驗將培養(yǎng)黃曲霉菌制備的AFB1添加到斷奶仔豬飼糧中，旨在考察飼糧添加0.3 mg/kg AFB1對斷奶仔豬生長性能、肝臟組織及腸道健康的影響，以期為深入認識AFB1毒性機理研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 黃曲霉毒素的培養(yǎng)和檢測

黃曲霉毒素的培養(yǎng)包括菌種活化、接種、發(fā)酵和收毒4個過程。1)活化：采用購自中國工業(yè)微生物菌種保存中心的黃曲霉產(chǎn)毒菌株ATCC28539經(jīng)過馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～8 d活化長出綠色孢子；2)接種：用10 mL 0.05%滅菌的吐溫20溶液沖洗PDA培養(yǎng)基中的黃曲霉孢子成孢子懸液，吸取4 mL孢子懸液接種于滅菌的大米培養(yǎng)基中；3)發(fā)酵：攪拌均勻后，25～28 ℃靜置培養(yǎng)8～12 d至綠色孢子長出，培養(yǎng)前3 d需隔8～12 h攪拌1次。4)收毒：所得黃曲霉毒素培養(yǎng)完畢后，向錐形瓶內(nèi)加入三氯甲烷淹沒和打濕長滿黃曲霉的培養(yǎng)基，4 ℃避光保存24 h或過夜后，于通風櫥65 ℃揮干氯仿，最后將培養(yǎng)基烘干、粉碎、裝袋，避光保存(此過程需要佩戴口罩或防毒面具)。

1.2 含黃曲霉毒素飼糧的制備和檢測

參照國標法將培養(yǎng)的黃曲霉毒素進行檢測，具體操作方法依照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(購自江蘇省蘇微微生物研究有限公司)說明書進行，發(fā)酵所得AFB1的含量為400 mg/kg。

然后按比例將培養(yǎng)的AFB1添加至基礎(chǔ)飼糧中，按照0.3 mg/kg AFB1計算，每噸飼糧中需加入0.75 kg發(fā)酵黃曲霉毒素替代部分玉米與之逐級混勻。飼糧中毒素含量則用高效液相色譜法測得，其中黃曲霉毒素含量用GB/T 30955—2014免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定；嘔吐毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)含量用GB/T 30956—2014免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測定；玉米赤霉烯酮含量用GB/T 28716—2012免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測定；赭曲霉素A含量用GB/T 30957—2014免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測定；伏馬毒素含量用GB/T 25228—2010免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測定；T-2毒素含量用GB/T 23501—2009免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測定。經(jīng)測定，飼糧中AFB1含量為363.3 μg/kg，黃曲霉毒素B2(AFB2)含量為34.6 μg/kg，黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)未檢測到，而常見霉菌毒素都未超標，檢測具體結(jié)果見表1。

表1 飼糧中常見霉菌毒素的含量(實測值)Table 1 Common mycotoxin contents in diets (measured values) μg/kg

1.3 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗選用32頭胎次相近、21日齡的“杜長大”斷奶仔豬，根據(jù)體重相近原則隨機分為2組(每組16個重復，每個重復1頭豬)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)和含有0.3mg/kgAFB1的飼糧(AFB1組)。預試期3 d，正試期21 d。

1.4 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)仔豬營養(yǎng)需要標準并結(jié)合實際配制，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)維生素預混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 8 000 IU，VD32 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg ，VB11.5 mg，VB25.6 mg，VB120.02 mg，VB61.5 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 10 mg，煙酸 nicotinic acid 15 mg，生物素biotin 0.1 mg，葉酸 folic acid 0.6 mg。
2)礦物質(zhì)預混料為每千克飼糧提供 Mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (FeSO4·H2O) 100 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 150 mg，Mn (MnSO4·H2O) 20 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 100 mg，I (KI) 0.3 mg，Se (Na2SeO3) 0.3 mg。
3)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所科研基地仔豬舍進行。動物飼養(yǎng)管理按斷奶仔豬飼養(yǎng)管理方式進行。預試期3 d，正式試驗每天飼喂4次(08:00、12:00、16:00和20:00)，每次喂料量以吃飽后飼槽內(nèi)略有余料為宜，采用自由飲水、自由采食和少喂勤添的原則。于正式試驗當天早晨空腹稱重分組，正式試驗后在第22天早上進行稱重。每組選取6頭和全組平均體重相近的豬只進行采血屠宰取樣。

1.6 樣品采集

飼糧樣品：通過四分法采集飼糧樣品，每組取300 g左右，裝入樣品袋并標記，送給北京中檢維康公司檢測黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素等6種常見霉菌毒素的含量。

肝臟樣品：全部試驗仔豬屠宰后迅速將肝臟完整取出稱重，同時對肝臟同一部位取基因樣迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存待測。對肝臟另一部位取切片樣置于4%多聚甲醛中保存待測。

腸道樣品：將全部試驗仔豬小腸的腸系膜解剖干凈，并立即放在冰塊上，從幽門到Treitz韌帶的部分認為是十二指腸，小腸末端接近回盲連接部的10 cm為回腸，而小腸剩下的部分為空腸。取十二指腸、空腸、回腸和盲腸食糜，裝于滅菌凍存管迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存待測。取十二指腸、空腸、回腸中部部分(各4 cm)，放置在4%多聚甲醛中保存檢測。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 生長性能

于試驗的第1天和第22天08:00空腹稱量全部試驗豬只體重，準確記錄好每天的給料量、剩余料和浪費料量，計算仔豬的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.7.2 肝臟指數(shù)

肝臟指數(shù)(g/kg)=肝臟重量(g)/活體重(kg)。

1.7.3 組織形態(tài)學觀察

將置于4%多聚甲醛固定液中的肝臟、十二指腸、空腸和回腸組織經(jīng)干燥脫水、浸蠟包埋及切片等處理，再經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，采用Leica DM1000顯微成像系統(tǒng)對結(jié)果進行拍照，觀察組織病理學變化，用ImageProPlus 6.0選取10個最典型的視野測定腸道絨毛高度和隱窩深度進行測量在顯微鏡下進行觀察，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。樣品在成都里來生物公司測定。

1.7.4 肝臟代謝相關(guān)基因mRNA表達量測定

提取肝臟總RNA，具體參照TaKaRa RNAiso Plus說明書進行，然后進行反轉(zhuǎn)錄，具體參照TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進行，實時熒光定量PCR則參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書、采用10 μL體系進行，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TliRNaseH Plus)(2×) 5.0 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.2 μL,DNA模板1.0 μL,上、下游引物各0.4 μL和3.0 μL ddH2O。實時熒光定量PCR的反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40個循環(huán)。熔解曲線反應程序為，95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。β-肌動蛋白(β-actin)作內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算各基因的相對表達量。

引物序列設(shè)計利用NCBI搜索目的基因片段，運用Primer 3進行引物設(shè)計，于生工生物工程(上海)股份有限公司合成。各基因具體引物序列見表3。

表3 基因引物序列Table 3 Primer sequences of genes

1.7.5 腸道食糜微生物菌群的數(shù)量

測定回腸、盲腸食糜微生物菌群數(shù)量采用反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)技術(shù)，以每克內(nèi)容物為檢測單位，通過Ct值與標準曲線計算得出每份樣品所含拷貝數(shù)，結(jié)果用每克內(nèi)容物中細菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)[lg(CFU/g)]表示。食糜DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒(Omega,美國)進行。PCR條件：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；最佳退火溫度，25 s；40個循環(huán)；95 ℃，10 s。熔解曲線：65～95 ℃，溫度以0.5 ℃/s提升。檢測乳酸桿菌、大腸桿菌和芽孢桿菌采用20 μL反應體系，包括Probe Ehance Solution 1 μL,Real Mater Mix 8 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,探針0.3 μL和ddH2O 7.7 μL；檢測雙歧桿菌采用20 μL反應體系，包括Probe Ehance Solution 1 μL,Real Mater Mix 8 μL,DNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL、探針0.8 μL和7.2 μL ddH2O；檢測總菌采用25 μL反應體系：SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL和9.5 μL ddH2O。以上Probe Ehance Solution和Real Mater Mix是北京天根生化科技有限公司的探針Mix試劑盒里的2種試劑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行整理，采用SPSS 19.0軟件進行t檢驗，結(jié)果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 AFB1對斷奶仔豬生長性能的影響

由表5可知，與對照組相比，AFB1組試驗豬ADG降低了23.81%，差異顯著(P<0.05)，ADFI降低了15.66%(P=0.09)，F(xiàn)/G顯著提高(P<0.05)

表4 RT-PCR引物序列及退火溫度Table 4 Primer sequences and annealed temperature for RT-PCR[3]

表5 AFB1對斷奶仔豬生長性能的影響Table 5 Effects of AFB1 on growth performance of weaned piglets

2.2 AFB1對斷奶仔豬肝臟的影響

2.2.1 AFB1對斷奶仔豬肝臟指數(shù)的影響

由圖1可知，與對照組相比，AFB1組斷奶仔豬肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。* mean significantly different (P<0.05).
圖1AFB1對斷奶仔豬肝臟指數(shù)的影響
Fig.1 Effect of AFB1 on hepatic index of weaned piglets

2.2.2 AFB1對斷奶仔豬肝臟形態(tài)的影響

由圖2可知，與對照組相比，AFB1組仔豬肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞中度水腫變性，部分出現(xiàn)中、重局灶狀壞死，肝纖維組織增生明顯。

2.2.3 AFB1對斷奶仔豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達量的影響

由表6可知，與對照組相比，AFB1組乙酰輔酶A羧化酶-1(ACC-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的mRNA表達量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 AFB1對斷奶仔豬腸道健康的影響

2.3.1 AFB1對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表7可知，與對照組相比，AFB1組十二指腸絨毛高度和隱窩深度顯著增加(P<0.05)，空腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，回腸的絨毛高度、隱窩深度和V/C值都無顯著差異(P>0.05)。

AFB1組上方箭頭表示肝小葉，下方箭頭表示肝細胞。
Upper arrow of AFB1 group mean hepatic lobule, and lower arrow mean hepatocyte.
圖2AFB1對斷奶仔豬肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響
Fig.2 Effect of AFB1 on organizational structure of liver of weaned piglets

表6 AFB1對斷奶仔豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達量的影響Table 6 Effects of AFB1 on lipometabolism-related gene mRNA expression in liver of weaned piglets

表7 AFB1對斷奶仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 7 Effects of AFB1 on intestinal morphology of weaned pigs

2.3.2 AFB1對斷奶仔豬腸道微生物數(shù)量的影響

由表8可知，與對照組相比，AFB1組盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，但盲腸總菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)，且回腸微生物數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

Grenier等[4]用Meta分析得出現(xiàn)在研究AFB1時常用劑量為0.3～2.0 mg/kg，其中0.3 mg/kg是介于正常情況和天氣不佳時容易發(fā)生AFB1的臨界值，故本試驗選用的AFB1劑量為臨界值0.3 mg/kg。此外，本試驗在Shotwell等[5]的發(fā)酵方法上進行條件改造所得AFB1，其含量用目前國際上普遍采用的定量檢測黃曲霉毒素方法(免疫親和柱凈化-高效液相色譜法)測定[6]。結(jié)果表明試驗所用毒素91%黃曲霉毒素為AFB1，飼糧中其他霉菌毒素都未見超標，說明此發(fā)酵培養(yǎng)方法獲得的AFB1純度很高且不適宜其他霉菌毒素生長，適合單一AFB1研究。

表8 AFB1對斷奶仔豬腸道微生物數(shù)量的影響Table 8 Effects of AFB1 on intestinal microflora amounts of weaned piglets lg(CFU/g)

AFB1作為一級致癌物質(zhì)，其中毒主要癥狀是阻礙豬的生長發(fā)育和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，造成動物亞健康導致飼料的浪費和上市時間的延長，從而造成經(jīng)濟損失[7]。研究表明，AFB1能不同程度降低豬ADFI和ADG，提高飼料轉(zhuǎn)化率，且年齡越小、劑量越高、時間越長，AFB1對動物損傷就越大[2]。本試驗結(jié)果表明AFB1顯著降低仔豬ADG，有降低ADFI的趨勢，且顯著提高F/G，說明0.3 mg/kg AFB1會抑制仔豬的生長。但本試驗結(jié)果與Rustemeyer等[8]用劑量0.25 mg/kg飼喂生長閹公豬的結(jié)果不一致，其在第5周開始出現(xiàn)ADFI顯著下降，對ADG無顯著影響，而本試驗中，0.3 mg/kg AFB1的毒性效應在前2周就體現(xiàn)，可能原因是動物日齡越大，對AFB1的耐受力越強。

肝臟是代謝的主要場所，也是AFB1的主要靶器官。有研究表明，AFB1會通過增加肝臟的重量，影響肉雞的生長性能[9]。本試驗AFB1顯著增加了肝臟指數(shù)，且病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFB1造成肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞中度水腫變性，部分出現(xiàn)中、重局灶狀壞死，肝纖維組織增生明顯，說明AFB1對肝臟造成了病理損傷。此外，有研究表明，AFB1降低脂肪代謝基因PPARα的表達，可能導致脂肪代謝紊亂而增加肝臟脂肪的堆積[10]。所以本試驗測定了肝臟代謝相關(guān)基因，但結(jié)果無顯著差異。結(jié)合HE染色結(jié)果(圖2)分析，AFB1造成肝臟相對重量增加可能是線粒體氧化酶系統(tǒng)受損的組織學變化結(jié)果。當肝臟受損時，肝細胞的線粒體氧化酶系統(tǒng)被破壞，ATP生成減少，細胞膜的鈉泵障礙，導致細胞內(nèi)鈉離子增多，水分進入細胞增多，細胞腫大或形成水泡變性[11-12]。

小腸絨毛高度、隱窩深度、V/C值是衡量小腸消化吸收能力的重要指標。隱窩深度可以反映隱窩細胞的增殖率和成熟度，而腸道絨毛高度則可以間接反映腸黏膜吸收細胞和分泌細胞比例及腸黏膜對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[13]。本試驗中，AFB1能顯著增加十二指腸絨毛高度和隱窩深度，對V/C值也有增加的趨勢，顯著降低空腸的隱窩深度，表明AFB1能改變腸道形態(tài)，影響腸道正常發(fā)育和功能，這與馮光德[13]結(jié)果一致。這可能是由于80% AFB1在胃腸道前端通過被動運輸被機體吸收，其中50%在十二指腸被吸收[4]。為降低細胞內(nèi)外AFB1濃度差，十二指腸絨毛高度增加。但是AFB1會降低細胞的合成[13]，所以隱窩細胞生成率和分泌率下降，增加十二指腸隱窩深度。而本試驗中AFB1能降低空腸隱窩深度，可能是AFB1造成機體代謝紊亂的一種補償效應。

腸道微生物對動物健康有重要影響，破壞其生態(tài)平衡可能會損害宿主的健康。有研究表明，250 μg/kg BW的AFB1能顯著降低雄性昆明小鼠盲腸食糜乳酸菌、雙歧桿菌和總厭氧菌等腸道有益菌的數(shù)目，從而造成腸道菌群失調(diào)[12]。本試驗結(jié)果與Ezz El-Arab等[14]研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)AFB1能顯著降低后腸雙歧桿菌的數(shù)目，說明AFB1對腸道微生物穩(wěn)態(tài)的影響可能主要是降低有益菌的數(shù)目。此外，肝臟的功能狀態(tài)與腸道微生態(tài)平衡息息相關(guān)[13]，它能夠代謝轉(zhuǎn)化來自腸道的有害物質(zhì)以及分泌游離型膽汁酸調(diào)節(jié)后腸pH，維持腸道菌群平衡[15-16]，所以腸道微生物的變化也可能與AFB1損傷肝臟有關(guān)。

4 結(jié) 論

飼喂含有0.3 mg/kg AFB1的飼糧會導致斷奶仔豬生長性能下降，肝臟組織和腸道健康輕微受損。