畢小娟 陳代文 余 冰 何 軍 毛湘冰 鄭 萍 黃志清 羅鈞秋 羅玉衡 虞 潔

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

黃曲霉毒素B1(AFB1)是一類毒性極強(qiáng)的霉菌毒素[1]。AFB1污染造成的飼料原料浪費(fèi)和動(dòng)物生產(chǎn)性能下降給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物采食被AFB1污染的飼糧后，80%黃曲霉毒素在胃腸道前端快速通過被動(dòng)運(yùn)輸被機(jī)體吸收，后轉(zhuǎn)入肝臟進(jìn)行代謝，從而出現(xiàn)肝臟損傷、食欲降低以及生長(zhǎng)性能下降等中毒現(xiàn)象[2]。腸道作為AFB1吸收的主要部位，毒素濃度遠(yuǎn)高于其他部位，但是關(guān)于AFB1對(duì)胃腸道的影響研究知之甚少。腸道健康是人和動(dòng)物健康的關(guān)鍵因素，AFB1降低動(dòng)物生產(chǎn)力是否是通過損傷腸道健康來實(shí)現(xiàn)還有待研究。而目前關(guān)于AFB1研究所用材料多數(shù)采用自然霉變玉米，其中含有多種毒素可相互作用，不利于深入認(rèn)識(shí)AFB1的毒性效應(yīng)和機(jī)理。而對(duì)單一AFB1研究還較少，且所得結(jié)果差異較大。因此，本試驗(yàn)將培養(yǎng)黃曲霉菌制備的AFB1添加到斷奶仔豬飼糧中，旨在考察飼糧添加0.3 mg/kg AFB1對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、肝臟組織及腸道健康的影響，以期為深入認(rèn)識(shí)AFB1毒性機(jī)理研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 黃曲霉毒素的培養(yǎng)和檢測(cè)

黃曲霉毒素的培養(yǎng)包括菌種活化、接種、發(fā)酵和收毒4個(gè)過程。1)活化：采用購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存中心的黃曲霉產(chǎn)毒菌株ATCC28539經(jīng)過馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～8 d活化長(zhǎng)出綠色孢子；2)接種：用10 mL 0.05%滅菌的吐溫20溶液沖洗PDA培養(yǎng)基中的黃曲霉孢子成孢子懸液，吸取4 mL孢子懸液接種于滅菌的大米培養(yǎng)基中；3)發(fā)酵：攪拌均勻后，25～28 ℃靜置培養(yǎng)8～12 d至綠色孢子長(zhǎng)出，培養(yǎng)前3 d需隔8～12 h攪拌1次。4)收毒：所得黃曲霉毒素培養(yǎng)完畢后，向錐形瓶?jī)?nèi)加入三氯甲烷淹沒和打濕長(zhǎng)滿黃曲霉的培養(yǎng)基，4 ℃避光保存24 h或過夜后，于通風(fēng)櫥65 ℃揮干氯仿，最后將培養(yǎng)基烘干、粉碎、裝袋，避光保存(此過程需要佩戴口罩或防毒面具)。

1.2 含黃曲霉毒素飼糧的制備和檢測(cè)

參照國(guó)標(biāo)法將培養(yǎng)的黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法依照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(購(gòu)自江蘇省蘇微微生物研究有限公司)說明書進(jìn)行，發(fā)酵所得AFB1的含量為400 mg/kg。

然后按比例將培養(yǎng)的AFB1添加至基礎(chǔ)飼糧中，按照0.3 mg/kg AFB1計(jì)算，每噸飼糧中需加入0.75 kg發(fā)酵黃曲霉毒素替代部分玉米與之逐級(jí)混勻。飼糧中毒素含量則用高效液相色譜法測(cè)得，其中黃曲霉毒素含量用GB/T 30955—2014免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測(cè)定；嘔吐毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)含量用GB/T 30956—2014免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定；玉米赤霉烯酮含量用GB/T 28716—2012免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定；赭曲霉素A含量用GB/T 30957—2014免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定；伏馬毒素含量用GB/T 25228—2010免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定；T-2毒素含量用GB/T 23501—2009免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，飼糧中AFB1含量為363.3 μg/kg，黃曲霉毒素B2(AFB2)含量為34.6 μg/kg，黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)未檢測(cè)到，而常見霉菌毒素都未超標(biāo)，檢測(cè)具體結(jié)果見表1。

表1 飼糧中常見霉菌毒素的含量(實(shí)測(cè)值)Table 1 Common mycotoxin contents in diets (measured values) μg/kg

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用32頭胎次相近、21日齡的“杜長(zhǎng)大”斷奶仔豬，根據(jù)體重相近原則隨機(jī)分為2組(每組16個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)和含有0.3mg/kgAFB1的飼糧(AFB1組)。預(yù)試期3 d，正試期21 d。

1.4 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)仔豬營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合實(shí)際配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 8 000 IU，VD32 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg ，VB11.5 mg，VB25.6 mg，VB120.02 mg，VB61.5 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 10 mg，煙酸 nicotinic acid 15 mg，生物素biotin 0.1 mg，葉酸 folic acid 0.6 mg。
2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (FeSO4·H2O) 100 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 150 mg，Mn (MnSO4·H2O) 20 mg，Zn (ZnSO4·H2O) 100 mg，I (KI) 0.3 mg，Se (Na2SeO3) 0.3 mg。
3)營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所科研基地仔豬舍進(jìn)行。動(dòng)物飼養(yǎng)管理按斷奶仔豬飼養(yǎng)管理方式進(jìn)行。預(yù)試期3 d，正式試驗(yàn)每天飼喂4次(08:00、12:00、16:00和20:00)，每次喂料量以吃飽后飼槽內(nèi)略有余料為宜，采用自由飲水、自由采食和少喂勤添的原則。于正式試驗(yàn)當(dāng)天早晨空腹稱重分組，正式試驗(yàn)后在第22天早上進(jìn)行稱重。每組選取6頭和全組平均體重相近的豬只進(jìn)行采血屠宰取樣。

1.6 樣品采集

飼糧樣品：通過四分法采集飼糧樣品，每組取300 g左右，裝入樣品袋并標(biāo)記，送給北京中檢維康公司檢測(cè)黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素等6種常見霉菌毒素的含量。

肝臟樣品：全部試驗(yàn)仔豬屠宰后迅速將肝臟完整取出稱重，同時(shí)對(duì)肝臟同一部位取基因樣迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存待測(cè)。對(duì)肝臟另一部位取切片樣置于4%多聚甲醛中保存待測(cè)。

腸道樣品：將全部試驗(yàn)仔豬小腸的腸系膜解剖干凈，并立即放在冰塊上，從幽門到Treitz韌帶的部分認(rèn)為是十二指腸，小腸末端接近回盲連接部的10 cm為回腸，而小腸剩下的部分為空腸。取十二指腸、空腸、回腸和盲腸食糜，裝于滅菌凍存管迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存待測(cè)。取十二指腸、空腸、回腸中部部分(各4 cm)，放置在4%多聚甲醛中保存檢測(cè)。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.7.1 生長(zhǎng)性能

于試驗(yàn)的第1天和第22天08:00空腹稱量全部試驗(yàn)豬只體重，準(zhǔn)確記錄好每天的給料量、剩余料和浪費(fèi)料量，計(jì)算仔豬的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.7.2 肝臟指數(shù)

肝臟指數(shù)(g/kg)=肝臟重量(g)/活體重(kg)。

1.7.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

將置于4%多聚甲醛固定液中的肝臟、十二指腸、空腸和回腸組織經(jīng)干燥脫水、浸蠟包埋及切片等處理，再經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，采用Leica DM1000顯微成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行拍照，觀察組織病理學(xué)變化，用ImageProPlus 6.0選取10個(gè)最典型的視野測(cè)定腸道絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)量在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。樣品在成都里來生物公司測(cè)定。

1.7.4 肝臟代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量測(cè)定

提取肝臟總RNA，具體參照TaKaRa RNAiso Plus說明書進(jìn)行，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體參照TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光定量PCR則參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書、采用10 μL體系進(jìn)行，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TliRNaseH Plus)(2×) 5.0 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.2 μL,DNA模板1.0 μL,上、下游引物各0.4 μL和3.0 μL ddH2O。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

引物序列設(shè)計(jì)利用NCBI搜索目的基因片段，運(yùn)用Primer 3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，于生工生物工程(上海)股份有限公司合成。各基因具體引物序列見表3。

表3 基因引物序列Table 3 Primer sequences of genes

1.7.5 腸道食糜微生物菌群的數(shù)量

測(cè)定回腸、盲腸食糜微生物菌群數(shù)量采用反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)技術(shù)，以每克內(nèi)容物為檢測(cè)單位，通過Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出每份樣品所含拷貝數(shù)，結(jié)果用每克內(nèi)容物中細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)[lg(CFU/g)]表示。食糜DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒(Omega,美國(guó))進(jìn)行。PCR條件：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；最佳退火溫度，25 s；40個(gè)循環(huán)；95 ℃，10 s。熔解曲線：65～95 ℃，溫度以0.5 ℃/s提升。檢測(cè)乳酸桿菌、大腸桿菌和芽孢桿菌采用20 μL反應(yīng)體系，包括Probe Ehance Solution 1 μL,Real Mater Mix 8 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,探針0.3 μL和ddH2O 7.7 μL；檢測(cè)雙歧桿菌采用20 μL反應(yīng)體系，包括Probe Ehance Solution 1 μL,Real Mater Mix 8 μL,DNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL、探針0.8 μL和7.2 μL ddH2O；檢測(cè)總菌采用25 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL和9.5 μL ddH2O。以上Probe Ehance Solution和Real Mater Mix是北京天根生化科技有限公司的探針Mix試劑盒里的2種試劑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 AFB1對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，AFB1組試驗(yàn)豬ADG降低了23.81%，差異顯著(P<0.05)，ADFI降低了15.66%(P=0.09)，F(xiàn)/G顯著提高(P<0.05)

表4 RT-PCR引物序列及退火溫度Table 4 Primer sequences and annealed temperature for RT-PCR[3]

表5 AFB1對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 5 Effects of AFB1 on growth performance of weaned piglets

2.2 AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟的影響

2.2.1 AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟指數(shù)的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，AFB1組斷奶仔豬肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。* mean significantly different (P<0.05).
圖1AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟指數(shù)的影響
Fig.1 Effect of AFB1 on hepatic index of weaned piglets

2.2.2 AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟形態(tài)的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，AFB1組仔豬肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞中度水腫變性，部分出現(xiàn)中、重局灶狀壞死，肝纖維組織增生明顯。

2.2.3 AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，AFB1組乙酰輔酶A羧化酶-1(ACC-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的mRNA表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 AFB1對(duì)斷奶仔豬腸道健康的影響

2.3.1 AFB1對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，AFB1組十二指腸絨毛高度和隱窩深度顯著增加(P<0.05)，空腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，回腸的絨毛高度、隱窩深度和V/C值都無顯著差異(P>0.05)。

AFB1組上方箭頭表示肝小葉，下方箭頭表示肝細(xì)胞。
Upper arrow of AFB1 group mean hepatic lobule, and lower arrow mean hepatocyte.
圖2AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響
Fig.2 Effect of AFB1 on organizational structure of liver of weaned piglets

表6 AFB1對(duì)斷奶仔豬肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Table 6 Effects of AFB1 on lipometabolism-related gene mRNA expression in liver of weaned piglets

表7 AFB1對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 7 Effects of AFB1 on intestinal morphology of weaned pigs

2.3.2 AFB1對(duì)斷奶仔豬腸道微生物數(shù)量的影響

由表8可知，與對(duì)照組相比，AFB1組盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，但盲腸總菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)，且回腸微生物數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

Grenier等[4]用Meta分析得出現(xiàn)在研究AFB1時(shí)常用劑量為0.3～2.0 mg/kg，其中0.3 mg/kg是介于正常情況和天氣不佳時(shí)容易發(fā)生AFB1的臨界值，故本試驗(yàn)選用的AFB1劑量為臨界值0.3 mg/kg。此外，本試驗(yàn)在Shotwell等[5]的發(fā)酵方法上進(jìn)行條件改造所得AFB1，其含量用目前國(guó)際上普遍采用的定量檢測(cè)黃曲霉毒素方法(免疫親和柱凈化-高效液相色譜法)測(cè)定[6]。結(jié)果表明試驗(yàn)所用毒素91%黃曲霉毒素為AFB1，飼糧中其他霉菌毒素都未見超標(biāo)，說明此發(fā)酵培養(yǎng)方法獲得的AFB1純度很高且不適宜其他霉菌毒素生長(zhǎng)，適合單一AFB1研究。

表8 AFB1對(duì)斷奶仔豬腸道微生物數(shù)量的影響Table 8 Effects of AFB1 on intestinal microflora amounts of weaned piglets lg(CFU/g)

AFB1作為一級(jí)致癌物質(zhì)，其中毒主要癥狀是阻礙豬的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，造成動(dòng)物亞健康導(dǎo)致飼料的浪費(fèi)和上市時(shí)間的延長(zhǎng)，從而造成經(jīng)濟(jì)損失[7]。研究表明，AFB1能不同程度降低豬ADFI和ADG，提高飼料轉(zhuǎn)化率，且年齡越小、劑量越高、時(shí)間越長(zhǎng)，AFB1對(duì)動(dòng)物損傷就越大[2]。本試驗(yàn)結(jié)果表明AFB1顯著降低仔豬ADG，有降低ADFI的趨勢(shì)，且顯著提高F/G，說明0.3 mg/kg AFB1會(huì)抑制仔豬的生長(zhǎng)。但本試驗(yàn)結(jié)果與Rustemeyer等[8]用劑量0.25 mg/kg飼喂生長(zhǎng)閹公豬的結(jié)果不一致，其在第5周開始出現(xiàn)ADFI顯著下降，對(duì)ADG無顯著影響，而本試驗(yàn)中，0.3 mg/kg AFB1的毒性效應(yīng)在前2周就體現(xiàn)，可能原因是動(dòng)物日齡越大，對(duì)AFB1的耐受力越強(qiáng)。

肝臟是代謝的主要場(chǎng)所，也是AFB1的主要靶器官。有研究表明，AFB1會(huì)通過增加肝臟的重量，影響肉雞的生長(zhǎng)性能[9]。本試驗(yàn)AFB1顯著增加了肝臟指數(shù)，且病理切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFB1造成肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞中度水腫變性，部分出現(xiàn)中、重局灶狀壞死，肝纖維組織增生明顯，說明AFB1對(duì)肝臟造成了病理損傷。此外，有研究表明，AFB1降低脂肪代謝基因PPARα的表達(dá)，可能導(dǎo)致脂肪代謝紊亂而增加肝臟脂肪的堆積[10]。所以本試驗(yàn)測(cè)定了肝臟代謝相關(guān)基因，但結(jié)果無顯著差異。結(jié)合HE染色結(jié)果(圖2)分析，AFB1造成肝臟相對(duì)重量增加可能是線粒體氧化酶系統(tǒng)受損的組織學(xué)變化結(jié)果。當(dāng)肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞的線粒體氧化酶系統(tǒng)被破壞，ATP生成減少，細(xì)胞膜的鈉泵障礙，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子增多，水分進(jìn)入細(xì)胞增多，細(xì)胞腫大或形成水泡變性[11-12]。

小腸絨毛高度、隱窩深度、V/C值是衡量小腸消化吸收能力的重要指標(biāo)。隱窩深度可以反映隱窩細(xì)胞的增殖率和成熟度，而腸道絨毛高度則可以間接反映腸黏膜吸收細(xì)胞和分泌細(xì)胞比例及腸黏膜對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[13]。本試驗(yàn)中，AFB1能顯著增加十二指腸絨毛高度和隱窩深度，對(duì)V/C值也有增加的趨勢(shì)，顯著降低空腸的隱窩深度，表明AFB1能改變腸道形態(tài)，影響腸道正常發(fā)育和功能，這與馮光德[13]結(jié)果一致。這可能是由于80% AFB1在胃腸道前端通過被動(dòng)運(yùn)輸被機(jī)體吸收，其中50%在十二指腸被吸收[4]。為降低細(xì)胞內(nèi)外AFB1濃度差，十二指腸絨毛高度增加。但是AFB1會(huì)降低細(xì)胞的合成[13]，所以隱窩細(xì)胞生成率和分泌率下降，增加十二指腸隱窩深度。而本試驗(yàn)中AFB1能降低空腸隱窩深度，可能是AFB1造成機(jī)體代謝紊亂的一種補(bǔ)償效應(yīng)。

腸道微生物對(duì)動(dòng)物健康有重要影響，破壞其生態(tài)平衡可能會(huì)損害宿主的健康。有研究表明，250 μg/kg BW的AFB1能顯著降低雄性昆明小鼠盲腸食糜乳酸菌、雙歧桿菌和總厭氧菌等腸道有益菌的數(shù)目，從而造成腸道菌群失調(diào)[12]。本試驗(yàn)結(jié)果與Ezz El-Arab等[14]研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)AFB1能顯著降低后腸雙歧桿菌的數(shù)目，說明AFB1對(duì)腸道微生物穩(wěn)態(tài)的影響可能主要是降低有益菌的數(shù)目。此外，肝臟的功能狀態(tài)與腸道微生態(tài)平衡息息相關(guān)[13]，它能夠代謝轉(zhuǎn)化來自腸道的有害物質(zhì)以及分泌游離型膽汁酸調(diào)節(jié)后腸pH，維持腸道菌群平衡[15-16]，所以腸道微生物的變化也可能與AFB1損傷肝臟有關(guān)。

4 結(jié) 論

飼喂含有0.3 mg/kg AFB1的飼糧會(huì)導(dǎo)致斷奶仔豬生長(zhǎng)性能下降，肝臟組織和腸道健康輕微受損。