馬萬(wàn)浩 張 寧,2 李 飛* 李發(fā)弟,3

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730020；2.新希望六和股份有限公司，北京 100102；3.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤 733300)

反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其內(nèi)生存著大量的微生物。根據(jù)微生物的分布形態(tài)，可分為液相、固相和固液混合相。而微生物中起主要消化分解作用的是細(xì)菌，主要可分為纖維素降解菌、淀粉降解菌、半纖維素降解菌、脂肪降解菌、乳酸利用菌和乳酸產(chǎn)生菌等[1]。

瘤胃微生物區(qū)系可受到自身采食的飼糧影響[2-3]。不同的斷奶和補(bǔ)飼時(shí)間可以使反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入發(fā)生改變，影響瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃組織的發(fā)育，進(jìn)而影響飼料利用率[4-5]。另外，羔羊隨著日齡的增長(zhǎng)，飼糧采食量會(huì)發(fā)生改變，大量的外界微生物也會(huì)植入到瘤胃中，使瘤胃內(nèi)的微生物區(qū)系日漸豐富。能夠降解利用纖維素是羔羊反芻功能形成的標(biāo)志之一，這與瘤胃內(nèi)纖維素降解菌的定殖有關(guān)，因此本試驗(yàn)選用白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌等幾種主要的纖維素降解菌和1種半纖維素降解菌布氏密螺旋體作為檢測(cè)瘤胃內(nèi)微生物動(dòng)態(tài)變化的研究對(duì)象，另外鑒于飼糧所含淀粉對(duì)羔羊生長(zhǎng)發(fā)育的重要性，本試驗(yàn)所研究的細(xì)菌還包括1種重要的淀粉降解菌牛鏈球菌。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)具有可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性高、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)[6]，被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性分析中。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和DGGE技術(shù)，研究斷奶日齡對(duì)羔羊瘤胃內(nèi)微生物多樣性的影響，同時(shí)檢測(cè)初生到84日齡羔羊瘤胃內(nèi)微生物的動(dòng)態(tài)變化，為明確斷奶日齡對(duì)羔羊瘤胃微生物區(qū)系的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

選取體重[(3.51±0.57) kg]接近、健康狀況良好的66只湖羊公羔，在1、14和28日齡各屠宰6只羊。剩余的48只按照體重相近原則隨機(jī)分為28日齡斷奶組和56日齡斷奶組。所有試驗(yàn)動(dòng)物從出生后7日齡飼喂開(kāi)食料，59日齡換生長(zhǎng)羔羊顆粒料，換料過(guò)渡期為10 d。28日齡斷奶組和56日齡斷奶組在42、56、70、84日齡分別屠宰6只。試驗(yàn)中所用湖羊羔羊均購(gòu)于甘肅省金昌中天羊業(yè)有限公司。試驗(yàn)期為羔羊1～84日齡。

1.2 樣品采集

動(dòng)物屠宰打開(kāi)瘤胃后，取出瘤胃內(nèi)容物用勻漿機(jī)混勻，所有內(nèi)容物過(guò)4層紗布得到瘤胃液，然后將瘤胃液裝入凍存管，放入裝有液氮的液氮罐中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后將樣品置于-80 ℃保存。

1.3 PCR分析

實(shí)時(shí)定量RCR的操作儀器為Bio-Rad CFX 96型實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(BioRad,美國(guó))。以SYBR Premix Ex TaqTM試劑(北京全式金生物技術(shù)有限責(zé)任公司)建立20 μL反應(yīng)體系,包括SYBR Green Ⅰ型熒光染料10 μL、上游和下游引物各0.4 μL、總DNA模板2 μL及雙蒸去離子水7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s并采集突光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。按儀器操作說(shuō)明選擇熔解曲線進(jìn)行后續(xù)分析。

瘤胃微生物16S rDNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增采用以下體系(50 μL)：2 μL總DNA模板(約100 ng)； GC-338f和533r引物各0.6 μL；5 μL buffer，4 μL dNTP，0.8 μL Taq聚合酶(TIANGEN Taq Polymerase)；37 μL雙蒸去離子水。

GC-338f引物序列：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(下劃線部分為GC夾子);533r 引物序列：5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′。

PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃，72 ℃30 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物參數(shù)Table 1 Parameters of primers for real-time PCR

依據(jù)下列公式計(jì)算目標(biāo)微生物相對(duì)豐度：

微生物相對(duì)豐度(%)=2-(Ct目標(biāo)菌-Ct總細(xì)菌)。

式中：Ct目標(biāo)菌為以目標(biāo)菌引物擴(kuò)增后所測(cè)循環(huán)閾值;Ct總細(xì)菌為以總細(xì)菌引物擴(kuò)增后所測(cè)循環(huán)閾值。

1.4 DGGE分析

DGGE分析參照張寧[10]的方法。

1.5 聚類分析

UPGAMA聚類分析參照周奕毅[11]的方法。

當(dāng)加速度計(jì)靜止時(shí),由于只受重力作用,各軸上的測(cè)量參數(shù)在空間坐標(biāo)系上理想分布為球心在原點(diǎn)、半徑為g的球面上。由于加速度計(jì)的刻度誤差和軸間偏置誤差等因素影響,加速度計(jì)所測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)分布在近似橢球的表面上。在各種姿態(tài)下采樣加速度計(jì)的測(cè)量數(shù)據(jù)并進(jìn)行基于最小二乘法的橢球擬合,求出球心偏置位置和橢球的各個(gè)軸長(zhǎng),即可得到測(cè)量值與理想值之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系,實(shí)現(xiàn)誤差補(bǔ)償。橢球最小二乘擬合算法的采樣點(diǎn)空間分布如圖2所示。

1.6 數(shù)據(jù)分析

DGGE圖譜通過(guò)Quantity-One(Bio-Rad)軟件處理比較每個(gè)泳道樣品間的相似性，并進(jìn)行UPGAMA聚類分析[11],另外用該軟件分析DGGE圖譜得到Shannon-Wiener多樣性指數(shù)。數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA提取效果，經(jīng)過(guò)分析凝膠成像系統(tǒng)成像圖，本試驗(yàn)所用微生物總DNA提取成功。用提取的微生物總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出16S rDNA V3區(qū)片段(圖1)。

圖1 16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA V3 region

斷奶日齡對(duì)瘤胃內(nèi)白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、牛鏈球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和布氏密螺旋體相對(duì)豐度的影響見(jiàn)圖2。斷奶日齡對(duì)白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、牛鏈球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和布氏密螺旋體的相對(duì)豐度無(wú)顯著影響(P>0.05)。28日齡斷奶組瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌相對(duì)豐度呈現(xiàn)28日齡較低，42日齡達(dá)到最高，之后逐漸下降的趨勢(shì)。56日齡斷奶組瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌相對(duì)豐度呈現(xiàn)28日齡較低，42日齡達(dá)到最高，之后下降，在70日齡達(dá)最低，84日齡略升高的趨勢(shì)；42日齡顯著高于70和84日齡(P<0.05)，其他日齡之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。70日齡時(shí)，28日齡斷奶組瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌相對(duì)豐度顯著高于56日齡斷奶組(P<0.05)。

本文DGGE圖譜(圖3、圖4)和聚類分析圖譜(圖5)僅展示部分樣品。28和56日齡斷奶羔羊瘤胃微生物DGGE圖譜見(jiàn)圖3。羔羊1～84日齡瘤胃內(nèi)微生物DGGE圖譜見(jiàn)圖4，對(duì)1～84日齡瘤胃內(nèi)微生物DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，可知隨著日齡的增長(zhǎng)，同一時(shí)間點(diǎn)的不同羔羊間的相似度逐漸升高，波動(dòng)最大的為1～14日齡和56～70日齡這2個(gè)時(shí)間段。

根據(jù)DGGE圖譜計(jì)算出多樣性指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在42 日齡時(shí)28日齡斷奶組多樣性指數(shù)顯著高于56日齡斷奶組(P<0.05)，在70日齡時(shí)28日齡斷奶組和56日齡斷奶組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從瘤胃內(nèi)整個(gè)微生物區(qū)系的發(fā)育角度來(lái)看，70和84日齡的多樣性指數(shù)顯著高于所有其他日齡(P<0.05)，1日齡顯著低于所有其他日齡(P<0.05)，其他日齡間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

本試驗(yàn)中，70日齡時(shí)28日齡斷奶組羔羊瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌的相對(duì)豐度顯著高于56日齡斷奶組，56日齡斷奶組日齡的變化引起瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌的相對(duì)豐度出現(xiàn)差異。Jami等[12]通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)犢牛從出生到成年瘤胃內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)犢牛斷奶后瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量下降。本課題組的另一項(xiàng)研究顯示，56日齡斷奶組在斷奶后采食量升高(569.03 g/d vs. 333.83 g/d)[13]，28日齡斷奶組與56日齡斷奶組瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌在70日齡所產(chǎn)生的差異可能是由于采食量的升高導(dǎo)致瘤胃內(nèi)pH降低，不利于溶纖維丁酸弧菌生長(zhǎng)。

柴建民[14]通過(guò)研究10、20、30日齡3個(gè)早期斷奶處理的羔羊發(fā)現(xiàn)，跟60日齡斷奶相比較，早期斷奶羔羊瘤胃內(nèi)微生物的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與對(duì)照組差異顯著，說(shuō)明斷奶對(duì)瘤胃中微生物區(qū)系具有很大的影響，韓旭峰[15]采用精粗比分別為30∶70、50∶50、70∶30的3種飼糧飼喂陜北白絨山羊發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧精粗比的升高，幾種不同功能的瘤胃細(xì)菌出現(xiàn)了變化，纖維降解菌的含量呈顯著減少的趨勢(shì)。Jami等[12]檢測(cè)了以色列荷斯坦牛從出生到24月齡的5個(gè)不同月齡階段的瘤胃微生物，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，牛瘤胃微生物的多樣性和數(shù)量呈現(xiàn)出了顯著變化。

同組數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；同一時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)。
Data points of the same group with different small letters mean significant difference (P<0.05); data points of the same time point with * mean significant difference (P<0.05).
圖228和56日齡斷奶羔羊瘤胃纖維分解菌的相對(duì)豐度
Fig.2 Relative abundance of cellulolytic bacteria in rumen of lambs weaned at 28 and 56 days of age

圖3 28和56日齡斷奶羔羊瘤胃微生物DGGE圖譜Fig.3 DGGE profiles of ruminal microbe of lambs weaned at 28 and 56 days of age

圖4 羔羊1～84日齡瘤胃內(nèi)微生物DGGE圖譜Fig.4 DGGE profiles of ruminal microbe of lambs at 1 to 84 days of age

圖5 羔羊1～84日齡瘤胃內(nèi)微生物聚類分析圖譜Fig.5 Cluster analysis map of ruminal microbe of lambs at 1 to 84 days of age

表2 羔羊瘤胃微生物多樣性指數(shù)Table 2 The diversity index of ruminal microbe of lambs

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。
Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

42日齡時(shí)28日齡斷奶組與56日齡斷奶組條帶數(shù)目和顏色深度出現(xiàn)差異且明顯，這由于28日齡斷奶組斷奶后加大了開(kāi)食料的采食量，因?yàn)椴煌暭Z顆粒上附著的微生物群落數(shù)量基本相同[16]，所以開(kāi)食料的采食加快了瘤胃內(nèi)微生物的植入速度。70日齡時(shí)56日齡斷奶組條帶數(shù)目和顏色深度均高于28日齡斷奶組，56日齡斷奶組斷奶后開(kāi)食料采食量會(huì)增加，會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物植入的速度明顯加快。Chen[17]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)犢牛飼糧轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸鬯较鄬?duì)較高的高谷物飼糧時(shí)，犢牛瘤胃微生物菌群組成的多樣性降低；另外，根據(jù)Khafipour等[8]、Tajima等[18]和張紅濤[19]的研究，飼糧中性洗滌纖維(NDF)水平的升高使得瘤胃微生物區(qū)系的物種豐富度和多樣性均增高，本文在將開(kāi)食料改變?yōu)樯L(zhǎng)羔羊顆粒料時(shí)，淀粉水平由38.81%降低為28.93%，NDF水平由18%升高至22%，這種飼糧營(yíng)養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)變也可能是56日齡斷奶組微生物種類、數(shù)量較大的原因。

隨著日齡的增長(zhǎng)，羔羊固體料的采食量會(huì)隨之增長(zhǎng)，固體料采食的增長(zhǎng)會(huì)引起瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系產(chǎn)生變化[20]。14日齡的DGGE圖譜條帶數(shù)目和顏色深度明顯高于7日齡。這是由于在7日齡對(duì)羔羊進(jìn)行了補(bǔ)飼，雖然日齡較小的羔羊?qū)腆w開(kāi)食料采食量并不大，但是通過(guò)舔舐固體料可以讓微生物植入瘤胃[21]。70日齡的DGGE圖譜條帶數(shù)目高于56日齡，鑒于56～70日齡羔羊瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸的含量顯著升高(102.31 mmol/L vs. 96.72 mmol/L),而瘤胃內(nèi)pH也呈增高趨勢(shì)[22]，這說(shuō)明在將開(kāi)食料更換為生長(zhǎng)羔羊料后，瘤胃微生物群落的活動(dòng)使得飼糧在瘤胃中迅速發(fā)酵，而發(fā)酵底物的增多則有利于微生物增殖，同樣的，相對(duì)較高的pH也有利于纖維降解菌的增殖，因此這種現(xiàn)象可能是由斷奶后開(kāi)食料采食量增加以及固體飼料的成分的轉(zhuǎn)變共同引起的。

Bomba等[23]通過(guò)對(duì)比7周齡斷奶與9周齡斷奶犢牛瘤胃內(nèi)微生物發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)通過(guò)早期補(bǔ)飼開(kāi)食料7周齡犢牛瘤胃內(nèi)微生物發(fā)育與9周齡犢牛差異不大。在本研究中也是在28日齡斷奶的情況下采取了早期補(bǔ)飼的措施，因此我們的研究結(jié)果與Bomba等[23]一致。Yáez-Ruiz等[24]研究表明，剛出生的反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)含有極少數(shù)的微生物甚至不含有微生物，隨著與外界接觸微生物逐漸植入到瘤胃中。本試驗(yàn)中隨著日齡的增長(zhǎng)，組內(nèi)相似度逐漸升高，這與Rey等[25]的研究結(jié)果一致。隨著日齡的增長(zhǎng)，反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的微生物區(qū)系逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，達(dá)到一種動(dòng)態(tài)的平衡，說(shuō)明隨飼糧植入的微生物對(duì)瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系的影響已逐漸變小。從1～84日齡組內(nèi)相似度逐漸升高的趨勢(shì)下，波動(dòng)最大的為1～14日齡和56～70日齡這2個(gè)時(shí)間段。本研究在7日齡對(duì)羔羊補(bǔ)飼開(kāi)食料以及在56日齡進(jìn)行了斷奶，這2個(gè)處理改變了羔羊飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入組成，因此引起了瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系的變化。

Bomba等[23]研究發(fā)現(xiàn)，犢牛斷奶后瘤胃內(nèi)微生物多樣性指數(shù)呈顯著性升高。本試驗(yàn)中，28日齡斷奶組在42日齡時(shí)已經(jīng)斷奶，而56日齡斷奶組在42日齡時(shí)仍未斷奶，造成了在42日齡時(shí)28日齡斷奶組多樣性指數(shù)顯著高于56日齡斷奶組。從結(jié)果中可以得出，7日齡補(bǔ)飼和56日齡斷奶對(duì)瘤胃內(nèi)的微生物區(qū)系影響較大。Jami等[12]研究發(fā)現(xiàn)，改變反芻動(dòng)物的飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成可以直接影響瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系的組成。本研究補(bǔ)飼與斷奶的處理間接改變了動(dòng)物飼糧營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)組成。

4 結(jié) 論

① 在7日齡開(kāi)始飼喂開(kāi)食料條件下，28日齡斷奶的羔羊瘤胃微生物多樣性在42日齡時(shí)較56日齡斷奶的羔羊豐富。

② 羔羊瘤胃內(nèi)微生物多樣性隨著日齡的增長(zhǎng)逐漸豐富，14日齡(7日齡開(kāi)始補(bǔ)飼開(kāi)食料)較1日齡顯著增加，70日齡較斷奶(56日齡)前顯著增加。