馬遠斌 胡丙杰

1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室（廣州 510080）；2廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)教研室法醫(yī)學(xué)組（廣州 511436）

準確的死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷對劃定偵察范圍、確定和排除犯罪嫌疑人、財產(chǎn)繼承及保險理賠等方面都有非常重要的意義。尸斑在死亡時間推斷方面被廣泛應(yīng)用，但以往主要根據(jù)尸斑的顏色和分布、指壓是否裉色等肉眼觀察的方法進行推斷，缺乏客觀性［1?3］。關(guān)于尸斑的客觀測量方法研究較少［4?10］。KAATSCH［4?5］和VANEZIS［6］用三色色度計對尸斑進行研究發(fā)現(xiàn)尸斑顏色的變化數(shù)值與死亡時間之間有相關(guān)，IN?OUE［7］利用近紅外光吸收血液成分的原理設(shè)計測量尸斑程度的儀器，用普通光630 nm作為特征峰，發(fā)現(xiàn)測量數(shù)值與死亡時間之間相關(guān)性較好。但上述研究結(jié)果并不理想，實驗方法針對性較差，推斷的準確性也較低。本研究旨在研制出便攜式儀器，改進測量方法，利用動物實驗，將影響因素控制到最小，以期提高尸斑用于死亡時間推斷的準確性。

1 材料與方法

1.1 尸斑的動物模型制作家兔8只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg（中山大學(xué)動物實驗中心提供），在室內(nèi)空調(diào)溫度設(shè)定25℃，通風(fēng)櫥與外界相通的環(huán)境條件下，通過機械性窒息方式處死后，用8%的硫化鈉酒精溶液對家兔頸、胸、腹三處進行整體脫毛，仰臥位平衡放置于通風(fēng)櫥內(nèi)，即完成動物模型制作。

1.2 尸斑測量儀器的設(shè)計制作

1.2.1 尸斑吸光度測量儀的設(shè)計、工作原理以及使用方法由上海儀器儀表研究所進行研制。當儀器開機后，電壓調(diào)整電路DC?DC直流變換器開始工作，向氙管提供能量，輕按儀器探頭，觸發(fā)開關(guān)，致使氙管閃光，光線通過光導(dǎo)纖維探頭的外環(huán)部分照射到被測量皮膚處，而后反射光經(jīng)光導(dǎo)纖維內(nèi)環(huán)傳導(dǎo)回儀器內(nèi)部濾光片，反射光中500～600 nm光線通過濾光片后傳到光電管，再由光電轉(zhuǎn)換電路再送到門電路，通過計數(shù)電路由狀態(tài)控制電路控制，把測得的數(shù)據(jù)顯示出來。按一下復(fù)位鍵，原顯示數(shù)據(jù)清隱，過5 s左右，Ready指示發(fā)光管亮后，可進行第二次測試。

1.2.2 尸斑分光光度計驗證步驟取10 mL家兔頸動脈血置于抗凝管中，用尸斑分光光度計儀器探頭在抗凝管管底對血液進行吸光度值的測定，通過觀察吸光度值的變化與死亡時間的關(guān)系來判斷儀器的有效性。

1.3 尸斑的分光光度法測量家兔尸斑吸光度步驟

1.3.1 測量位置和測量點的選擇選擇尸斑明顯處（中背部和側(cè)背部）和尸斑不明顯甚至缺乏處（胸前、季肋上、季肋下、腹正中、側(cè)腹部和背壓部）共8個部位27個測量點作為測量點，其中：胸前2個點（劍突上0.5 cm位置及劍突上方2 cm位置，分別稱為胸前點、胸上點）；季肋上4個點（為季肋起點處、中點處，分別稱為左上季肋點、左中季肋點、右上季肋點、右中季肋點）；季肋下2個點（為季肋終點處，分別稱為左下季肋點、右下季肋點），腹正中線3個點（腹正中線上平第二、三、四對乳頭處，分別稱為腹上點、腹中點及腹下點），側(cè)腹4個點（兩側(cè)第二三乳頭中點處及第三四乳頭中點處，分別稱為左上腹點、左下腹點、右上腹點及右下腹點）；背壓部4個點（背脊對應(yīng)側(cè)腹相應(yīng)點位置水平脊柱旁1 cm處，分別稱為左上背壓點、左下背壓點、右上背壓點及右下背壓點）；中背部4個點（對應(yīng)背壓部兩個點水平脊柱旁3 cm處，分別稱為左上背點、左下背點、右上背點及右下背點）；側(cè)背部4個點（對應(yīng)背壓部脊柱旁5 cm處，分別稱為右上側(cè)背點、左下側(cè)背點、右上側(cè)背點及右下側(cè)背點）。

1.3.2 測量時間點的選擇死亡后4 h內(nèi)每1 h測量1次，第5～56 h內(nèi)每2 h測量1次。

1.3.3 測量方法用尸斑吸光度測量儀在每個測量點測量3次，測量手法是用儀器的探頭平放于測量位置，然后將探頭輕輕下壓，觸發(fā)開關(guān)激發(fā)氙光管閃光，讀數(shù)后即完成1次測量。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法先求出同一時間在同一測量點3次測量值的平均數(shù)，再求出同一測量位置的平均數(shù)，再將8只家兔的每次均數(shù)進行統(tǒng)計，求出總均數(shù)以及其95%可信區(qū)間等，然后進行8個測量位置吸光度值與死亡時間全程56 h以及分段的單因素回歸分析和多因素回歸分析，并求出回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 尸斑分光光度計驗證新鮮血液放在比色管中，紅細胞等密度最大的成分向管底沉降，速度為先快后慢，最后基本穩(wěn)定。本實驗中隨時間延長，儀器測得的血液吸光度值亦隨之增加，在16 h內(nèi)呈先快后慢最后穩(wěn)定不變（圖1）。

圖1 尸斑吸光度測量儀測得的血液沉降時間圖Fig.1 Light absorption value for blood sedimentation plotted against measurement time

2.2 8個測量位置吸光度值相對于死亡時間的散點圖見圖2。

2.3 統(tǒng)計分析

2.3.1 8個測量位置吸光度值與死亡時間的單因素回歸分析用SPSS 10.0軟件包對死亡56 h內(nèi)各測量位置吸光度值與死亡時間進行單因素回歸分析，結(jié)果表明：以死亡時間（PMI）大小為因變量（Y），以8個測量位置吸光度值為自變量（X）進行相關(guān)及回歸分析，給定α=0.05，結(jié)果：8個測量位置吸光度與死亡時間均存在相關(guān)，相關(guān)性大小依次為側(cè)背均，中背均，腹中均，側(cè)腹均，背壓均，胸前均，季下均，季上均；相關(guān)性最強的是中背均，其確定系數(shù)R2=0.552，回歸方程為Y=2.352X?10.331。

2.3.2 多元逐步回歸分析

2.3.2.1 總體數(shù)據(jù)多元回歸分析用SPSS 10.0軟件包對死亡56 h內(nèi)各測量位置吸光度值與死亡時間進行多元回歸分析，結(jié)果表明：以死亡時間（PMI）大小為因變量（Y），以單因素分析篩選出的因素為自變量（Xn）進行多元逐步回歸分析，進行回歸方程的變量共有5個，有側(cè)背均（X1）、中背均（X2）、季肋上均（X3）、側(cè)腹均（X4）及胸前均（X5），回歸方程如下：Y＝-10.627＋0.819X1＋1.380X2-2.385X3＋2.502X4-0.801X5，R2=0.736。

2.3.2.2 分段時間多元回歸分析以死亡時間（PMI）大小為因變量（Y），以單因素分析篩選出的因素為自變量（Xn）進行多元逐步回歸分析，給定α=0.05，結(jié)果如下：

圖2 家兔死后56 h內(nèi)吸光度平均值隨時間變化圖Fig.2 Light absorption value of 8 rabbits with different post?mortem intervals plotted against measurement time

2.3.2.2.1 死亡8 h內(nèi)進入方程的變量有中背均（X1）、季肋上均（X2）、背壓均（X3），Y=0.253＋0.570X1-0.739X2＋0.261X3，R2=0.728。

2.3.2.2.2 死亡8～32 h進入方程的變量有中背均（X1）、季肋上均（X2）、側(cè)腹均（X3）、背壓均（X4）及季肋下均（X5），Y=6.462+1.283X1-3.748X2＋2.971X3-1.293X4＋1.267X5，R2=0.626。

2.3.2.2.3 死亡32～56 h進入方程的變量只有側(cè)背均（X），Y=28.326＋0.824X，R2=0.370。

3 討論

3.1 尸斑吸光度測量儀的有效性和先進性尸斑是指尸體血液循環(huán)停止后，血管內(nèi)的血液由于自身重力，開始從尸體的高位流向低位，墜積在未受壓迫部位的血管中，使該處毛細血管擴張，充滿血液，并透過皮膚顯示出邊緣不清的血紅蛋白顏色的斑痕。由于紅細胞（包括血紅蛋白）在血液各種成分中密度最大，所以尸斑的形成過程從某種程度上來說主要是紅細胞等從尸體高位墜積到低下未受壓迫部位，隨著死亡時間延長，尸體低下部位紅細胞等增加，對特征峰的吸光度上升，而尸體高位紅細胞減少，對特征峰的吸光度下降。由于在500～600 nm范圍內(nèi)，人體血液主要成分中僅紅細胞及血紅蛋白（包括氧合血紅蛋白、還原血紅蛋白等）有吸收峰，而血漿、白細胞、血小板、淋巴細胞及血清膽紅素等其它血液成分在此范圍均無吸收峰，而且在此光譜范圍受黑色素和人體最大成分水的干擾亦較少［7，11］，因此通過測量相關(guān)部位血液在500～600 nm范圍的吸光度即可以客觀地對尸斑進行檢測。據(jù)此，筆者使用僅吸收500～600 nm范圍光的濾光片，研制出便攜式的尸斑吸光度測量儀（由上海儀器儀表研究所研制的嬰幼兒黃疸測量儀改制而成），對血液沉降的吸光度測量結(jié)果表明，隨著時間延長，儀器測得的血液吸光度值亦隨之增加，在16 h內(nèi)呈先快后慢最后穩(wěn)定不變。這與尸斑的形成過程類似，因此，該儀器可以對血液的沉降進行檢測。

尸斑出現(xiàn)時間的早晚與死亡當時血液的量和性狀有極大關(guān)系。由于試管內(nèi)血液量只有10 mL，影響因素單一，故在放置16 h血液沉降過程已經(jīng)完成。而動物或尸體血液量大且廣泛分布在血管和器官組織內(nèi)，尸斑形成過程中影響血液墜積和重新分布的因素非常復(fù)雜（如器官致密程度、血管分布與走向等），血液墜積過程難以在16 h內(nèi)完成，因此其曲線形態(tài)有較大不同。在死亡24 h后，所謂尸斑已經(jīng)“固定”是指指壓尸斑不退色而言，但隨著死亡時間的延長，高位血液的墜積并未停止，因此本實驗中在死后56 h仍可檢測家兔尸斑部位吸光度變化。

3.2 實驗結(jié)果分析

3.2.1 單因素回歸分析對56 h內(nèi)8個測量位置尸斑吸光度值與死亡時間的單因素回歸分析顯示，8個測量位置吸光度值推斷死亡時間的準確性不同。尸斑最明顯的低下未受壓部位（中背部和側(cè)背部）是推斷死亡時間最好的部位，但其他6個測量位置的吸光度值與死亡時間也存在相關(guān)關(guān)系，這提示我們，傳統(tǒng)的只對尸斑最明顯的部位，也就是尸體低下非受壓部位的尸斑進行測量是不完全的，對尸體側(cè)面甚至腹面的非尸斑處進行測量也可以用來推斷死亡時間。

3.2.2 多元回歸分析將家兔死亡56 h內(nèi)各測量位置吸光度值與死亡時間進行多元回歸分析，得出的多元回歸方程的R2=0.736，明顯高于VANEZ?IS［6］（R2=0.289）和 INOUE［7］（R2=0.563）的實驗結(jié)果，大大提高了推斷死亡時間的準確性，并可用于死后較長時間的死亡時間推斷，印證了KAATSCH［4?5］和 VANEZIS［6］的結(jié)論。究其原因，一方面是由于我們采用了更有特征性的吸收光譜（包含紅細胞和血紅蛋白的特征性吸收峰的寬光帶），另一方面是因為除對尸斑最明顯的部位進行測量外，我們還將尸斑不明顯處，甚至缺乏處也同時進行測量，通過測量尸體高位的紅細胞（包括血紅蛋白）的減少和低下未受壓迫部位紅細胞（包括血紅蛋白）的增加來綜合考慮推斷死亡時間（單一利用尸斑最明顯的中背處，其R2=0.552，綜合考慮后R2=0.736）。

3.2.3 分時間段單因素回歸分析對8個測量位置吸光度值與死亡時間的單因素回歸分析顯示，死亡8 h內(nèi)，軀體低下部位（中背、側(cè)背以及背壓部）的吸光度值與死亡時間有正相關(guān)，而側(cè)面及軀體較高位置的吸光度值與死亡時間沒有相關(guān)關(guān)系；死亡10～32 h，軀體較高位置（胸前、季肋上、季肋下）和軀體受壓位置（背壓部）的吸光度值與死亡時間之間亦沒有相關(guān)關(guān)系，而腹中部、腹側(cè)部以及軀體低下未受壓部位的吸光度值與死亡時間有正相關(guān)關(guān)系；死亡34～56 h，8個測量位置的吸光度值與死亡時間之間均存在著正相關(guān)關(guān)系，推斷的準確性依次為：側(cè)背均、側(cè)腹均、中背均、腹中均、季上均、背壓均、胸前均以及季下均，對推斷影響最大的還是低下非受壓部位（側(cè)背、中背）。死亡8 h內(nèi)回歸方程的R2=0.728，10～32 h內(nèi)回歸方程的R2=0.626，34～56 h內(nèi)回歸方程的R2=0.370?？梢钥闯?，前8h的預(yù)測準確性較高，中間24 h左右的預(yù)測準確性其次，最后20 h左右的預(yù)測準確性最差，這提示我們尸斑推斷死亡時間在前期的血流動力學(xué)方面比較一致，而隨著時間的發(fā)展，逐漸進入尸斑“固定”期，尸斑發(fā)展的血流動力學(xué)模型就比較難以預(yù)測，利用尸斑推斷死亡時間的準確性也在下降，其機制不明，可能與腐敗引起組織及血管破環(huán)致血管內(nèi)血液滲流到組織間隙，以及腐敗過程中紅細胞、血紅蛋白等物質(zhì)的變化以及吸收光譜的變化所致。盡管如此，同指壓尸斑觀察是否褪色的傳統(tǒng)方法相比，本方法的準確性明顯提高。因為，如果指壓尸斑完全褪色，壓力消除后尸斑又重新出現(xiàn)，只能粗略推斷是死后12 h內(nèi)；如果指壓尸斑不完全褪色，則推斷是死后12～24 h；如果指壓尸斑不再褪色，所謂尸斑已“固定”，則推斷是死后24 h以上［12］。

3.3 與其他死亡時間推斷方法的比較近年來，學(xué)者們在死亡時間推斷方面進行了新的探索和努力。WANG等［13］應(yīng)用紫外?可見光分光光度計和衰減全反射傅里葉變換紅外（attenuated total reflec?tion?Fourier transform infrared，ATR?FTIR）光譜技術(shù)分析大白兔在環(huán)境溫度25℃、相對濕度40%的實驗條件下左心室血漿吸光度和光譜學(xué)隨死亡時間推移的變化，為推斷死亡時間提供了新的實驗依據(jù)和方法。WU等［14］應(yīng)用氣相色譜?質(zhì)譜儀研究大鼠死后不同時間血液中55種代謝物的變化，并建立回歸方程。IWAMOTO等［15］應(yīng)用CT研究大鼠死后不同時間門靜脈和腸內(nèi)氣體含量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著死亡時間的延長，門靜脈內(nèi)氣體含量呈指數(shù)增加，腸內(nèi)氣體含量呈線性增加，提示測量死后尸體內(nèi)氣體的含量變化可以作為死亡時間推斷的指標。但同本研究相比，這些方法需要的設(shè)備昂貴，檢材處理操作復(fù)雜，不利于在基層檢案中推廣普及。

總之，本實驗所研制的針對紅細胞和血紅蛋白吸收特征峰的便攜式尸斑測量儀，更好地抓住了尸斑的本質(zhì)，綜合運用尸斑最濃部位和側(cè)面甚至高位等尸斑不明顯或缺乏部位的吸光度檢測可大大提高死亡時間推斷的準確性，為尸斑的客觀測量及死亡時間的推斷提供了新的方法，由于所研制的尸斑測量儀便于攜帶，操作簡單，尤其對由于各種原因不能實施解剖的案例仍可適用，顯示出較好的應(yīng)用前景。但由于本實驗只是在嚴格的實驗條件下動物實驗的結(jié)果，而在法醫(yī)學(xué)實踐中尸體所處的環(huán)境條件和影響因素要復(fù)雜得多［13?17］。所以要真正應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢案，有待進一步研究死亡原因、性別、胖瘦、季節(jié)、溫度、濕度等因素對尸斑形成的影響，并在法醫(yī)實際案件中進行驗證。