楊振棟 張云美 于亞峰

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（江蘇蘇州 215006）

衰老是人類不可避免的自然現(xiàn)象。隨著年齡的增長，各個器官都會經(jīng)歷退變的過程。年齡相關(guān)性聽力下降又稱老年性聾，它的病因相當(dāng)復(fù)雜，不僅與年齡相關(guān)，而且與遺傳、環(huán)境、社會等因素密切相關(guān)，是個多因素疾病。毛細胞的減少和螺旋神經(jīng)元的退變被認為是周圍聽覺系統(tǒng)退變的主要因素［1］。近年來，中樞聽覺系統(tǒng)的退變也被認為伴隨著周圍聽覺系統(tǒng)退變從而參與了老年性聾的病理過程［2］，導(dǎo)致其噪聲環(huán)境下言語理解能力及處理能力的下降。聽皮層作為聽覺中樞的高層，隨著年齡的增長同樣也出現(xiàn)了退變［3］。如何延緩老年性聾一直是個難題，聽覺中樞神經(jīng)元的再生還遙不可及。

神經(jīng)調(diào)節(jié)因子（neuregulins，NRGs）作為信號蛋白，介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、乳腺和其他器官系統(tǒng)細胞和細胞之間的聯(lián)系。NRG1是其中一種，屬于表皮生長因子家族成員。有研究表明NRG1?ErbB信號通路在內(nèi)耳的發(fā)育和成長過程中起著顯著的作用，NRG1能夠促進I型螺旋神經(jīng)元的存活［4］。那么，NRG1對聽皮層神經(jīng)元有無保護作用?本課題組選取老年C57BL/6J小鼠作為觀察對象，研究NRG1對其聽皮層是否有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料取6～8周、42～44周的雄性小鼠分為兩組，每組10只，頸椎脫臼處死后，迅速取出雙側(cè)聽皮層并放置于液氮中，采用RTPCR的方法檢測了兩組聽皮層NRG1的表達情況。取30只42～44周C57BL/6J雄性小鼠，按使用藥物的不同分為NRG1組、m?NGF組和生理鹽水組，分別給予NRG1 0.1 mg/mL，鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子（mouse neurotrophic factor，m?NGF）9 μg/mL以及生理鹽水，每組10只，采用腹腔注射的方法連續(xù)給藥8周，注射劑量均為0.1 mL/d。動物經(jīng)頸椎脫臼處死后，迅速取出聽皮層并放置于2%的戊二醛中固定，行透射電鏡觀察聽皮層神經(jīng)元等超微結(jié)構(gòu)。另取標本放置于4%的多聚甲醛中固定，行免疫組化觀察NRG1的表達變化。NRG1購自于美國的R&D systems。m?NGF購自于廈門北大之路生物工程有限公司。實驗動物購自于蘇州大學(xué)實驗動物中心，耳廓反射均可以引出。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量RTPCR檢測RNA的提取按Trizol法（Invitrogen，美國）進行，確定RNA濃度后進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：5×Prime?Script Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、oligo（dT）1 μL、Random 6 mers 1 μL、Total RNA 13 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，1 h；85℃，5 min。將制備好的cDNA和定量梯度陽性標準模板進行PCR擴增，擴增體系如下：2×Super?Real PreMix Plus 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 8 μL，總體系20 μL。PCR擴增條件：首先50℃作用3 min，接著95℃作用15 min，95℃作用10 s，55 ℃作用20 s，72 ℃ 作用30 s，接著40個循環(huán)95℃變性10 s。溶解曲線：從70℃到95℃，每增加0.5℃作用5 s。各引物序列為AC?TIN：上游 5′?GTGACGTTGACATCCGTAAAGA?3′，下游 5′?GCCGGACTCATCGTACTCC?3′；NRG1：上游 5′?TTCCCATTCTGGCTTGTCTAGT?3′，下游 5′?CCAGGGTCAAGGTGGGTAG?3′。

1.2.2 透射電鏡取出的聽皮層組織塊切1 mm3的大小。在2%戊二醛4℃下固定2 h，PBS緩沖液漂洗后1%鋨酸4℃下固定2 h，PBS緩沖液漂洗。梯度乙醇逐級脫水。環(huán)氧丙烷置換。環(huán)氧樹脂618包埋液與環(huán)氧丙烷（1∶1）浸透2 h，環(huán)氧樹脂618包埋液與環(huán)氧丙烷（2∶1）過夜，純環(huán)氧樹脂618包埋液浸透37℃6 h。包埋，切片。枸椽酸鉛電子染色。透射電鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化取出的聽皮層組織浸入4%的多聚甲醛固定液中過夜。固定好的組織行石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化，用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。切片在37℃下浸入1%BSA溶液（含0.3%triton?x?100）中封閉30 min。隨后入一抗：（NRG1 1∶100）。陰性對照組采用PBS緩沖液代替一抗。置4℃冰箱中過夜，隔1 d用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min后再入相關(guān)生物素化的二抗30 min（1∶200），用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min，然后浸入ABC溶液2 h，再用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。接著使用DAB顯色15 min后鏡下觀察中止反應(yīng)，復(fù)染使用蘇木精。0.01 mmol/L PBS清洗終止反應(yīng)后，用中性樹膠封片后即可于鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)采用正態(tài)分布檢驗、方差齊性檢驗，組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，所有統(tǒng)計資料以P＜0.05來表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量RTPCR結(jié)果以ACTIN的表達量作為參照標準來計算兩組聽皮層上的NRG1 mRNA的 ΔCt以及 ΔΔCt，最后通過計算公式2?ΔΔCT來分別計算各基因的相對表達水平。結(jié)果顯示NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠聽皮層上的表達（0.203 0±0.008 6）明顯少于6～8周（0.533 3±0.313 0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 透射電鏡觀察結(jié)果生理鹽水組脫髓鞘改變明顯（圖1A）。NRG1髓鞘扭曲情況較生理鹽水組改善（圖1B）。m?NGF組髓鞘較NRG1組有輕度脫髓鞘改變（圖1C）。

2.3 免疫組化結(jié)果聽皮層上免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒，其表達量使用IPP 6.0軟件所測得的平均光密度來表示（表1）。NRG1組NRG1的表達高于其他兩組（圖2A），而m?NGF組NRG1的表達（圖2B）高于生理鹽水組（圖2C）。

圖1 使用神經(jīng)調(diào)節(jié)因子后42～44周小鼠聽皮層超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察結(jié)果Fig.1 Ultrastructure of the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment observed by transmission electron microscopy

表1 3組NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠聽皮層上的表達Tab.1 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice

3 討論

臨床上老年性聾分為中樞性、周圍性和混合性3種，以混合性居多，即老年性聾患者同時有外周聽力障礙及中樞聽覺處理障礙。一般來說老年性聾分為4類，即感音性、神經(jīng)性、代謝性和機械性耳聾。后來又補充了中樞型老年性聾，即聽覺各級中樞呈現(xiàn)退行性變，這是導(dǎo)致老年人言語交往障礙的主要原因。這種現(xiàn)象又被稱作中樞聽覺功能障礙。

圖2 使用神經(jīng)調(diào)節(jié)因子后42～44周小鼠聽皮層NRG1的表達變化Fig.2 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment assessed with immunohistochemistry

NRG1主要表達在中樞的突觸區(qū)域，與突觸的傳遞密切相關(guān)［5］。廣泛的研究已經(jīng)表明NRG1通過正向和負向信號通路在突觸傳遞中起了關(guān)鍵的作用［6］。NRG1的正向信號通路通過把細胞外的區(qū)域與ErbB受體結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白例如神經(jīng)遞質(zhì)和離子通道的表達［7］。NRG1負向信號通路通過細胞質(zhì)區(qū)域的核易位能上調(diào)凋亡和突觸基因的表達［8］。

NRG1的中樞神經(jīng)保護作用已經(jīng)被國內(nèi)外文獻多次報道，比如在帕金森病，NRG1能夠保護受損的多巴胺能神經(jīng)元，能減少神經(jīng)元的凋亡［9］。那么NRG1對老年鼠聽覺系統(tǒng)的神經(jīng)元和突觸有無保護作用呢？有報道［10］NRG1在耳蝸和螺旋神經(jīng)元上皆有顯著的表達。近來有實驗指出轉(zhuǎn)有NRG1基因的小鼠聽力較好，原因是由于NRG1使毛細胞和螺旋神經(jīng)元間的突觸傳遞得到了增強［11］。

NRG1能否用于保護聽覺中樞尤其是聽皮層？筆者首先采用實時熒光定量RTPCR觀察NRG1在C57BL/6J小鼠聽皮層上的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長有下降趨勢。這表明老年小鼠聽皮層退變影響了突觸的傳遞，進而影響了聽皮層的功能。XU等［12］報道NRG1作為神經(jīng)保護因子，能夠保護小鼠小腦神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，表明在與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的神經(jīng)炎癥有潛在治療應(yīng)用。為了了解NRG1的保護作用，實驗中使用了兩種神經(jīng)保護因子，一種是NRG1，一種是臨床上已經(jīng)普遍使用的m?NGF，而生理鹽水作為對照。神經(jīng)生長因子在體外實驗中被證明能夠促進小鼠耳蝸神經(jīng)干細胞增殖和分化，其在治療神經(jīng)元聽力損失中起到了保護作用［13］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在體外研究中也證明對耳蝸有保護作用［14］。m?NGF作為常見的外源性神經(jīng)生長因子已被廣泛地認為能夠促進神經(jīng)元存活和生長的能力。m?NGF能夠作用于螺旋神經(jīng)元及外毛細胞進而保護聽力［15］。WANG等［16］研究認為m?NGF可作為DBA/2J小鼠的保護劑用于早期干預(yù)小鼠的進行性聽力損失。NRG1的結(jié)果如何呢？免疫組化提示使用NRG1和m?NGF以后老年小鼠的聽皮層神經(jīng)元上的NRG1表達明顯增高，尤其是NRG1。而通過電鏡來觀察聽皮層的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理鹽水組聽皮層脫髓鞘改變很明顯。m?NGF組脫髓鞘好轉(zhuǎn)，而NRG1組神髓鞘扭曲情況明顯好轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明神經(jīng)營養(yǎng)因子特別是NRG1對于老年小鼠的聽皮層還是有一定的保護作用。

雖然NRG1對于周圍聽覺系統(tǒng)以及中樞聽覺系統(tǒng)均顯示出一定的保護作用。然而老年性聾是個多因素疾病，NRG1能否應(yīng)用于臨床，療效如何都面臨著不小的挑戰(zhàn)。對于NRG1的具體機制還需要進一步的研究。