梁嘉穎 鄭毅春 李子濤 汪李虎 劉風華

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州510010）

準確的精液分析是診斷男性不育癥的第一步，目前常用的標準是世界衛(wèi)生組織2010年發(fā)布的《人類精液檢查與處理實驗室手冊第5版》（簡稱WHO第5版）［1］，其中精子總數、前向運動（progressive motility，PR）精子百分率和正常形態(tài)精子百分率是評價精子質量的重要依據。根據中華醫(yī)學會《臨床診療指南輔助生殖技術與精子庫分冊》［2］，治療輕、中度男性不育癥首選的輔助生殖技術（ART）是宮腔內人工授精（intrauterine insemination，IUI），而合并女方不孕因素、重度少、弱、畸精子癥及無精子癥等，則可進行體外授精（in vitrofertilization，IVF）或卵泡漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療。但影響ART成功率的因素很多，包括女方因素、用藥方案［3-4］、授精時機［5］、手術次數［6］、周期數［7］和男方精液因素［8-9］如優(yōu)化處理后的活動精子總數。大量研究證實，優(yōu)化處理后的活動精子數量不足會使ART的臨床妊娠率降低［10］。但目前并未明確限定精液優(yōu)化處理到授精的時間，且對延長該時間間隔與精子質量參數的相關性研究較少，而精子體外獲能時間是與患者個體情況無關的變量，相對于其他影響因素，其可控性較強，因此，根據 WHO第5版［1］和前期研究結果［11］，本實驗將精子體外獲能時間分為20、40、80和120 min，主要目的是探討優(yōu)化處理后精液孵育至授精之間最佳的時間間隔，從而更有效地提高ART成功率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象連續(xù)收集400例（正常精子、少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥各100例）于2017年1-12月在廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科就診的男性受試者。診斷標準參照WHO第5版，精子總數≥39×106，前向運動（PR）精子百分率≥32%，正常形態(tài)精子百分率≥4%為正常精子；精子總數 ＜39×106為少精子癥；PR%＜32%為弱精子癥；正常形態(tài)精子百分率＜4%為畸形精子癥［1］。所有受試者均簽署知情同意書，研究經醫(yī)院倫理委員會同意。

受試者年齡、精液體積、精子總數、濃度、總活力（progressive motility+non?progressive motility，PR+NP%）、PR%等數據組間差異見表1。

表1 優(yōu)化處理前各組精液標本參數Tab.1 The baseline characteristics of prewash semen samples（n=100） ± s

表1 優(yōu)化處理前各組精液標本參數Tab.1 The baseline characteristics of prewash semen samples（n=100） ± s

精液參數年齡（歲）精液體積（mL）精子總數（× 106）精子濃度（106/mL）PR%PR+NP%正常形態(tài)率（%）正常精子32.0±4.1 3.0±0.9 98.0±13.4 58.6±21.7 51.3±11.4 62.6±13.1 4.9±1.2少精子癥31.4±3.9 1.8±0.9 46.8±10.7 17.6±7.1 60.8±12.4 76.8±11.9 5.2±1.1弱精子癥31.7±2.8 2.6±0.9 92.5±14.0 46.2±19.1 25.5±5.3 51.6±10.5 5.0±0.8畸形精子癥30.6±3.1 2.9±0.8 96.8±12.9 40.5±24.3 52.3±12.4 74.8±12.1 2.1±1.1 F值1.27 10.92 16.73 13.58 15.62 16.00 11.37 P值0.206 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

1.1.2 主要儀器與試劑西班牙Microptic公司SCA計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）；日本Olym?pus公司BX53普通光學顯微鏡；德國Eppendorf公司的移液器；上海齊欣科學儀器有限公司CU?600電熱恒溫水浴箱；珠海貝索生物技術有限公司精子（細胞）形態(tài)學快速染色液（Diff?Quik法）；瑞典Vitrolife公司SpermGrad梯度液、SpermRinse洗精液、IVF受精培養(yǎng)液等。

1.2 方法

1.2.1 精液采集受檢者禁欲2～7 d，以手淫方式采集精液于潔凈無菌的一次性采精杯中，隨即放置37℃孵育箱20 min。記錄精液采集時間、精液優(yōu)化處理開始時間、精液優(yōu)化處理后孵育開始時間。

1.2.2 精液常規(guī)檢測按照WHO第5版［1］進行精液常規(guī)參數檢驗，記錄精液體積，并采用CASA系統(tǒng)分析觀察精子濃度、精子總數、PR+NP%和PR%。計算公式：精子總數=精液體積×精子濃度，PR精子總數=PR%×精子濃度×精液體積，活動精子總數=PR+NP%×精子濃度×精液體積。

1.2.3 精子形態(tài)分析采用Diff?Quik染色法［1］，普通光學顯微鏡下10×100倍油鏡觀察分析200條精子，計數頂體區(qū)異常、頭部異常、頸部和中段異常以及尾部異常精子數，計算正常形態(tài)精子百分率。

1.2.4 精液優(yōu)化處理采用密度梯度離心法，精液液化20 min后，制備1 mL＋1 mL 95%＋45%的SpermGrad梯度液分層，小心在最上層加入不超過1 mL精液。1 600 r/min離心20 min，吸管吸取最下層沉淀，在5 mL SpermRinse液中混勻，1 600 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入0.5 mL IVF培養(yǎng)液，混勻作為授精液，置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱；根據WHO第5版［1］和前期研究結果［11］，將孵育時間設為20、40、80和120 min，記錄每份精液優(yōu)選后及孵育各時間點的PR+NP%、活動精子總數、PR%和PR精子總數。

1.3 統(tǒng)計學方法用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，多個樣本組比較采用重復測量方差分析，兩兩組間比較用q檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常精子組精液優(yōu)化處理后參數比較根據表2所示，正常精子組的PR+NP%和活動精子總數在孵育40 min最高，在120 min最低；PR%和PR精子總數在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數在各時間點的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

表2 正常精子精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.2 Postwash semen parameters in different periods in group normozoospermia ±s

表2 正常精子精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.2 Postwash semen parameters in different periods in group normozoospermia ±s

注：與20 min比較，*P ＜0.01；與40 min比較，ΔP ＜0.01

精子參數精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數（×106）PR+NP%活動精子總數（×106）0 min 30.3±19.5 92.9±6.2 10.1±5.1 98.0±5.0Δ 11.7±5.8Δ 20 min 30.2±19.5 96.3±5.8 12.3±5.3 98.3±3.7Δ 13.4±4.1Δ 40 min 30.1±19.5 93.8±9.1*9.2±3.6*98.6±2.7 14.4±2.6 80 min 30.3±19.5 90.3±12.2*8.8±2.6*97.4±4.6Δ 11.3±2.6Δ 120 min 30.4±19.6 87.5±10.5*8.1±1.7*93.4±8.3Δ 10.1±5.4Δ F值0.004 13.620 18.160 16.730 15.560 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 少精子癥組精液優(yōu)化處理后參數比較根據表3所示，少精子癥組的PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數在各時間點的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

表3 少精子癥精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.3 Postwash semen parameters in different periods in group oligozoospermia ±s

表3 少精子癥精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.3 Postwash semen parameters in different periods in group oligozoospermia ±s

注：與20 min比較，*P＜0.01

精子參數精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數（×106）PR+NP%活動精子總數（×106）0 min 11.0±3.7 90.8±10.0 8.5±3.6 95.8±4.0 10.3±5.7 20 min 11.0±3.6 91.5±9.1 8.6±2.1 96.0±4.3 10.7±4.8 40 min 11.0±3.7 90.3±9.7*8.2±3.3*94.8±3.8*10.3±4.1*80 min 11.0±3.6 81.2±8.6*7.2±3.7*90.0±2.4*9.0±4.8*120 min 11.0±3.7 78.6±9.3*7.1±3.2*87.9±5.3*8.7±5.3*F值0.014 10.310 18.920 13.430 18.000 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 弱精子癥組精液優(yōu)化處理后參數比較根據表4所示，弱精子癥組的PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數在各時間點的差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。

表4 弱精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.4 Postwash semen parameters in different periods in group asthenozoospermia±s

表4 弱精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.4 Postwash semen parameters in different periods in group asthenozoospermia±s

注：與20 min比較，*P＜0.01

精子參數精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數（× 106）PR+NP%活動精子總數（×106）0 min 20.2±10.1 90.5±5.3 10.0±7.1 95.6±4.5 12.8±6.0 20 min 21.7±10.8 90.8±9.1 10.7±2.1 97.1±4.3 12.9±5.8 40 min 21.3±10.7 85.3±9.7*9.2±8.3*94.3±4.8*11.3±4.7*80 min 20.8±10.9 80.2±11.6*8.2±6.7*90.3±5.4*10.0±4.8*120 min 20.9±10.4 76.6±11.3*7.3±5.2*87.9±10.3*9.4±5.0*F值0.007 10.630 17.240 13.910 17.330 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 畸形精子癥組精液優(yōu)化處理后參數比較根據表5所示，畸形精子癥組的精子總活力和活動精子總數在孵育40 min最高，在120 min最低，PR%和PR精子總數在20 min最高，在120 min最低；采用多樣本組間方差分析，PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數在各時間點的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.5 正常精子組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組各時間點精液參數的比較重復測量方差分析結果顯示，優(yōu)選20 min后，正常生育組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組的各時間點精液參數差異均有顯著性（表6）。

2.6 精子獲能時間與IUI臨床妊娠率的關系選擇研究時間段內400例男性受試者中，妻子采用來曲唑（LE）促排方案進行IUI治療的242個周期。根據獲能時間的不同，分析了4組的臨床妊娠率，分別為13.9%、25.9%、11.8%和0%，40 min組顯著高于其他3組（均P＜0.05，表7）。

表5 畸形精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.5 Postwash semen parameters in different periods in group teratozoospermia ±s

表5 畸形精子癥組精液優(yōu)化處理后孵育不同時間的精子參數Tab.5 Postwash semen parameters in different periods in group teratozoospermia ±s

注：與20 min比較，*P ＜0.01；與40 min比較，ΔP＜0.01

精子參數精子濃度（106/mL）PR%PR精子總數（×106）PR+NP%活動精子總數（×106）0 min 30.5±14.3 92.3±2.4 13.2±6.3 97.0±1.1Δ 14.6±2.7Δ 20 min 30.7±13.8 93.4±5.1 14.0±7.1 97.1±1.3Δ 14.7±3.8Δ 40 min 30.3±12.1 92.7±4.5*13.2±6.3*98.3±2.8 15.3±4.1 80 min 30.1±10.9 84.2±1.6*11.2±6.7*92.3±6.4Δ 13.0±3.8Δ 120 min 30.0±12.4 78.6±1.3*10.1±7.2*87.9±10.9Δ 12.1±3.3Δ F值0.005 11.31 17.72 13.88 17.25 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 正常精子組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組各時間點精液參數的比較Tab.6 Postwash semen parameters in different periods in all groups

表7 精子獲能時間與宮腔內人工授精臨床妊娠率的關系Tab.7 Correlation of clinical pregnancy with the incubation time from the end of semen processing to intrauterine insemination±s

表7 精子獲能時間與宮腔內人工授精臨床妊娠率的關系Tab.7 Correlation of clinical pregnancy with the incubation time from the end of semen processing to intrauterine insemination±s

注：與40 min比較，*P＜0.05

女方年齡（歲）男方年齡（歲）不孕年限（年）臨床妊娠率［例/例（%）］20 min 30.7±1.8 33.4±5.1 3.0±0.1 10/72（13.9）*40 min 30.3±2.1 32.7±4.5 3.2±0.3 29/112（25.9）80 min 30.1±1.9 34.2±1.6 3.2±0.7 6/51（11.8）*120 min 30.0±1.4 33.6±1.3 3.1±0.2 0/7（0.0）*F/χ2值0.005 0.001 0.002 8.165 P值0.946 3.121 1.833 0.043

3 討論

IUI是治療輕度男性不育癥的首選ART，IUI簡單易行，費用低廉，不會引起嚴重的并發(fā)癥，IVF主要用于治療男方少、弱精子癥及女方存在配子運送障礙或排卵障礙等不孕因素的患者，ICSI則是用于嚴重的少、弱、畸精子癥或無精癥患者的有效治療方法［1-2］。正確的精液采集和優(yōu)化處理是ART中非常重要的環(huán)節(jié)，不正確的精液采集可能因未收集到完整的精液而影響精子質量，還可能導致ART治療失敗等嚴重不良后果；根據WHO第5版［1］要求，精液標本應該在靠近實驗室的私密房間采集，精液診斷性分析必須在采集后1 h內完成，因為標本的新鮮度會直接影響妊娠結局。精液離體后，精子的存活率和活動率會受體外溫度和時間的變化影響而逐漸下降，新鮮精液標本中，精子可以在12 h內保持一定的前向運動率，并可存活24～48 h。

精液優(yōu)化處理不僅可以去除精漿、不活動精子、畸形精子、細胞碎片和其他有害物質，還可制備含高比例的形態(tài)學正常的活動精子。因此，在進行各種ART治療前，精液標本必須進行優(yōu)化處理，以獲得最佳功能精子。受精前，精子需孵育一定時間進行獲能，獲能后的精子運動活躍、頂體和精膜的流動性明顯增加，具備發(fā)生頂體反應、精卵識別和融合的能力［12］，但孵育時間過長，培養(yǎng)液中的活動精子不斷消耗葡萄糖、果糖等能量，使能量耗盡而無法在IUI手術或體外受精后到達準確的受精部位；男性睪丸精子中阻礙受精的DNA碎片亦會隨獲能時間的延長而增加［13］；精子在培養(yǎng)液中孵育時間越長，自發(fā)頂體反應率越高，進而影響卵子正常受精而降低臨床妊娠率。本研究結果顯示，弱精子癥組精液在進行優(yōu)化處理后，置5%CO2、37℃、95%濕度環(huán)境下孵育20 min，PR%、PR精子總數、PR+NP%和活動精子總數均為最高，而正常精子組、少精子癥組和畸形精子癥組的精子質量參數在孵育40 min內，不會因孵育時間的延長而下降，但當孵育時間達到80～120 min，4組相關參數均顯著下降；每個時間點上4組比較結果為孵育20 min后，正常生育組、少精子癥組、弱精子癥組和畸形精子癥組各精子質量參數均有顯著性差異，提示弱精子癥組精子質量可能更易受孵育時間影響。本研究還提示，獲能時間在40 min的IUI臨床妊娠率最高，與FAUQUE等［14］研究結果相似，該研究認為，優(yōu)化處理后的精液在37℃孵育40～80 min能獲得最適宜的IUI臨床妊娠率。YAVAS等［15］則發(fā)現，精液采集后30 min內進行優(yōu)化處理比31～60 min組妊娠率顯著提高，精液采集后90 min內進行IUI比91～120 min組或＞120 min組妊娠率顯著升高。各研究得出的具體孵育時間雖不盡相同，可能是由于采用了不同的精液優(yōu)化處理技術或實驗室檢測技術［16］，但結果均顯示，延長精液優(yōu)化處理后至IUI手術或體外授精間隔時間，會對精子質量和臨床妊娠率產生負影響。

綜上所述，進行IUI治療的精子獲能時間應控制在40 min內，能顯著改善患者的精子質量，因此各生殖中心實驗室應根據不同病因患者選擇適當的精液優(yōu)化處理方法及精子體外獲能條件。精子體外獲能時間與ART臨床妊娠結局的關系仍需進行更大樣本，更全面的前瞻性隨機對照研究進一步驗證，才能得出更準確的結論。