宋 薇

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

復(fù)方紅景天口含片是由紅景天、制何首烏、黃精及甘草4味中藥組成的純中藥復(fù)方制劑，具有抗衰老，抗疲勞，改善記憶力，預(yù)防和治療老年癡呆的功效。為了更好地控制復(fù)方紅景天口含片的質(zhì)量，本試驗(yàn)采用薄層色譜(TLC)法對(duì)該方中的紅景天、何首烏、黃精藥材進(jìn)行了定性鑒別；采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)紅景天中的紅景天苷及酪醇進(jìn)行測(cè)定，所建立的方法簡(jiǎn)便、可靠、重現(xiàn)性好，能保證制劑的質(zhì)量。

1 材料

1.1儀器Aglient1120型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AE260型萬分之一電子天平(瑞士Mettle公司)；CP225D型十萬分之一電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；R-200型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SK3310LHC型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥紅景天苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110818-200401)；酪醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111676-200401)；2，3，5，4′- 四羥基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110844-200606)；復(fù)方紅景天口含片(甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，批號(hào)：2009091701、2009091702)；所需藥材由蘭州安泰堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院何福江實(shí)驗(yàn)員鑒定符合《中國(guó)藥典》2010版(一部)，乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1紅景天的鑒別稱取已粉碎過篩的不同批次復(fù)方紅景天口含片各2 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，濾過，合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液備用。分別稱取紅景天苷和酪醇對(duì)照品，加入甲醇配制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。稱取缺紅景天的復(fù)方紅景天口含片2 g，按口含片供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。稱取紅景天藥材粉末5.0 g，加入100 mL70%乙醇連續(xù)回流提取2小時(shí)，過濾，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL，取出5 mL蒸干，50 mL水溶解，用水飽和正丁醇萃取至無色，合并萃取液，蒸干，甲醇溶解，制成供試品溶液。吸取上述溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮(6∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

圖1 紅景天的TLC

2.2何首烏的鑒別稱取已粉碎過篩的不同批次復(fù)方紅景天口含片各2 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，濾過，合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液備用。稱取二苯乙烯苷對(duì)照品，加甲醇溶解配制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。稱取缺何首烏的復(fù)方紅景天口含片2 g，按口含片供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。稱取0.271 4 g制何首烏標(biāo)準(zhǔn)藥材加95%乙醇50 mL浸泡30分鐘，回流提取2次，1 h/次，合并濾液，濃縮至約3 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)藥材對(duì)照品溶液。吸取上述溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮-水(6∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，在 365 nm 熒光下觀察，斑點(diǎn)清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

3 含量測(cè)定

3.1紅景天苷及酪醇含量測(cè)定

3.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)；預(yù)柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm ×12.5 mm)；流動(dòng)相：乙腈 - 水(15∶85)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

3.1.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液，陰性樣品溶液，紅景天對(duì)照品溶液，酪醇對(duì)照品溶液各20 μL，依上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果紅景天苷和酪醇均能得到較好的分離，陰性無干擾，理論塔板數(shù)以紅景天苷計(jì)N＞3 000，以酪醇計(jì) N＞2 000，見圖 3。

圖3 HPLC色譜圖

3.1.3 溶液的制備

3.1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取紅景天苷、酪醇和二苯乙烯苷對(duì)照品3.21、18.00、1.62 mg，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，配制成濃度分別為 0.321、1.800、0.162 mg/mL的對(duì)照品溶液。

3.1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取粉碎過篩的復(fù)方紅景天口含片粉末約5 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，合并濾液，減壓濃縮至干，殘?jiān)眉状汲暼芙獠⒍ㄈ葜?0 mL容量瓶中，作為供試品儲(chǔ)備液，備用。精密量取供試品儲(chǔ)備液10 mL，蒸干，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.3.3 陰性樣品溶液的制備 分別精密稱量不含紅景天藥材的復(fù)方紅景天口含片陰性樣品各5 g，按“3.1.3.2”項(xiàng)下方法操作制得紅景天陰性樣品溶液。

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取濃度為0.321 mg/mL的紅景天苷對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于1 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容，分別進(jìn)樣20 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，紅景天苷含量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2.84725e-0.007X-0.999435，r=0.999 7。結(jié)果表明：紅景天苷在0.642～5.136 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。分別精密吸取濃度為1.800 mg/mL的酪醇對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0mL于1 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容，分別進(jìn)樣20 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，酪醇含量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.59549e-0.007X+0.0152195，r=0.999 1。結(jié)果表明酪醇在3.600～36.000 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.1.5 精密度試驗(yàn) 取已知濃度的紅景天苷和酪醇對(duì)照品溶液，依上述色譜條件各連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算，得紅景天苷和酪醇濃度的RSD為1.27%和1.08%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度較好。

3.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品制得的供試品溶液，精密吸取 20 μL 分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 小時(shí)，依“3.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，得紅景天苷和酪醇含量的RSD為2.29%和2.50%。結(jié)果表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)(2009091701)樣品 6份，按“3.1.3.2”項(xiàng)下方法操作制得供試品溶液，分別精密吸取 20 μL，依“3.1.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得紅景天苷和酪醇平均含量和 RSD值分別為 0.407%、0.0378%和1.74%、1.63%。

3.1.8 加樣回收率 精密稱取已知含量的復(fù)方紅景天口含片(2009091702)粉末0.1 g，加入濃度為0.993 mg/mL的紅景天苷對(duì)照品溶液及濃度為0.103 mg/mL的酪醇對(duì)照品溶液，按“3.1.3.2”項(xiàng)下方法操作制得供試品溶液，依上述色譜條件進(jìn)樣20 μL測(cè)定，計(jì)算，得紅景天苷和酪醇的平均加樣回收率和 RSD值分別為 100.29%、99.46%和1.69%、2.25%(n=6)，見表 1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

3.1.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取粉碎過篩的復(fù)方紅景天口含片粉末約5 g，按“3.1.3.2”項(xiàng)下操作制備供試品溶液，依法進(jìn)樣20 μL測(cè)定，計(jì)算。2批復(fù)方紅景天口含片中，紅景天苷的平均含量和RSD 值分別為 0.399%、0.402%和 2.44%、2.76%；酪醇的平均含量和RSD值分別為0.0375%、0.0372%和 1.54%、1.56%，結(jié)果見表 2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n=3) %

3.2二苯乙烯苷含量測(cè)定

3.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)；預(yù)柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm×12.5 mm)；流動(dòng)相：乙腈 -水(15∶85)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品1.62 mg，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為0.162 mg/mL的對(duì)照品溶液。

3.2.3 供試品溶液的制備 按“3.1.3.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液。

3.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 精密稱取不含制何首烏藥材的復(fù)方紅景天口含片樣品約5 g，按“3.2.3”項(xiàng)下方法操作制備何首烏陰性對(duì)照品溶液。

3.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取上述3種溶液各 20 μL，依“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明二苯乙烯苷可以得到較好的分離，陰性無干擾，理論塔板數(shù)以二苯乙烯苷計(jì)＞3 000。色譜圖見圖4。

圖4 HPLC色譜圖

3.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取濃度為0.162 mg/mL的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μL 于 1 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容，分別進(jìn)樣20 μL測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，二苯乙烯苷的含量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.280 54e-008X+0.004 483，r=0.999 3。結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.162～1.944μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品溶液，依“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，測(cè)得二苯乙烯苷含量的RSD為0.94%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度較好。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品溶液于0，2，4，6，8，12，24 小時(shí)，分別精密吸取 20 μL，依“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)得二苯乙烯苷含量的RSD為1.15%。結(jié)果表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)(2009091701)樣品6份，按“3.2.3”項(xiàng)下方法操作制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，依“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得二苯乙烯苷的平均含量為0.051%，RSD 為 2.63%。

3.2.10 加樣回收率 精密稱取已知含量的復(fù)方紅景天口含片(2009091702)粉末0.1 g，加入濃度為0.571 mg/mL的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液，按“3.2.3”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，依“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣20 μL測(cè)定，計(jì)算。二苯乙烯苷的平均加樣回收率為100.34%，RSD為1.75%(n=9)，結(jié)果見表 3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

3.2.11 樣品測(cè)定 精密稱取粉碎過篩的復(fù)方紅景天口含片粉末5 g，按“3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算，得兩批復(fù)方紅景天口含片樣品中二苯乙烯苷的平均含量分別為0.051%、0.052%；RSD分別為2.63%、2.86%，結(jié)果見表 4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

4 討論

《中國(guó)藥典》2010版(一部)紅景天藥材“鑒別及含量測(cè)定”項(xiàng)下僅收載了紅景天苷的TLC及HPLC測(cè)定法，而無酪醇的測(cè)定，考慮到紅景天苷及其苷元酪醇均為紅景天的重要活性成分［2］，本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方紅景天口含片中紅景天苷及其苷元酪醇的測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、可行，且重現(xiàn)性好，為含紅景天藥材的中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

本研究曾先后采用乙腈-0.02%磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀、乙腈-2%甲醇、乙腈-水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水(8.5∶91.5)作為流動(dòng)相分離效果最佳，穩(wěn)定性最好，圖形最佳，故以此作為HPLC法的洗脫系統(tǒng)。