張廣和， 李國(guó)鵬， 李心慰， 韓天龍,3， 劉國(guó)文

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；2.內(nèi)蒙古赤峰市國(guó)營(yíng)農(nóng)牧場(chǎng)綜合服務(wù)站，內(nèi)蒙古赤峰 024000；3.赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古赤峰 024031）

奶牛圍產(chǎn)期是指妊娠奶牛分娩前和分娩后的一段時(shí)期，一般指產(chǎn)前3周和產(chǎn)后3周共6～8周的時(shí)期，國(guó)外多稱之為過(guò)渡期。圍產(chǎn)期奶牛由于經(jīng)歷妊娠、分娩和泌乳三個(gè)階段的生理應(yīng)激，體內(nèi)代謝發(fā)生劇烈變化，尤其是干物質(zhì)攝入不足導(dǎo)致的能量負(fù)平衡，使圍產(chǎn)期奶牛健康和繁殖生產(chǎn)遭受嚴(yán)重威脅。葡萄糖是反芻動(dòng)物能量的主要來(lái)源，參與機(jī)體多種生理代謝過(guò)程，也是泌乳合成乳糖的重要物質(zhì)來(lái)源。反芻動(dòng)物葡萄糖合成主要由內(nèi)源性生成和外源性吸收獲得，其中以內(nèi)源性生成為主（妖軍虎，2013）。日糧提供的碳水化合物在瘤胃微生物作用下生成丙酸被瘤胃壁吸收轉(zhuǎn)至肝臟經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)最終進(jìn)入血液供機(jī)體利用。所以血液中葡萄糖濃度變化對(duì)于了解機(jī)體能量變化情況是最直接的參考依據(jù)。奶牛低血糖癥是由眾多因素引起血糖濃度降到正常值外的一種臨床常見(jiàn)綜合征，低血糖主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌腺、肝臟、胃腸、營(yíng)養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)。它是糖代謝紊亂的一個(gè)反應(yīng)指標(biāo)而不是疾病診斷的本質(zhì)。本研究對(duì)圍產(chǎn)期奶牛低血糖發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，目的是了解圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡的嚴(yán)重程度以及發(fā)生疾病的預(yù)警，對(duì)于預(yù)測(cè)圍產(chǎn)期奶牛群體性能量負(fù)平衡提供參考；血液生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè)從能量、肝功能以及礦物質(zhì)代謝方面了解圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥發(fā)生的代謝情況，為早期疾病預(yù)防帶來(lái)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)選取吉林省長(zhǎng)春市某奶牛場(chǎng)圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛171頭，通過(guò)臨床癥狀、胎次、產(chǎn)奶量、體況評(píng)分（BCS）、干物質(zhì)攝入量（DMI）和血液相關(guān)指標(biāo)等，最終篩選出53頭奶牛為本試驗(yàn)低血糖組奶牛。低血糖癥奶牛的判定標(biāo)準(zhǔn)是GLU＜2.5 mmol/L。選取53頭健康奶牛作為對(duì)照組。在發(fā)病率調(diào)查中，以周為時(shí)間單位，選取7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不少于17頭奶牛。試驗(yàn)組和對(duì)照組所有奶牛日糧均按NRC標(biāo)準(zhǔn)配制，采用舍飼，自由采食。

1.2 循環(huán)血液樣本的采集 根據(jù)場(chǎng)內(nèi)管理系統(tǒng)記錄，計(jì)算奶牛預(yù)產(chǎn)期，選擇產(chǎn)前3周（-21 d）、2 周（-14 d）、1 周（-7 d）、分娩當(dāng)天（0 d）和產(chǎn)后1周（7 d）、2 周（14 d）、3 周（21 d）7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圍產(chǎn)期奶牛和健康奶牛，每頭奶牛血液樣品的采集均于清晨投飼前頸靜脈無(wú)菌采集20 mL。10 mL血液肝素鈉抗凝處理用做分離血漿，另10 mL血液不添加抗凝劑用做分離血清。分別于3800 g離心10 min，收集血漿（或血清）于事先準(zhǔn)備好的無(wú)菌凍存管中，準(zhǔn)確標(biāo)記后，-80℃保存待測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法 測(cè)定指標(biāo)具體為：葡萄糖（GLU）、β-羥丁酸 （BHBA）、 非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG） 、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、乳酸脫氫酶（LDH）、鈣（Ca）、鎂（Mg）和磷（P）。 采用常規(guī)生化試劑盒于吉林大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科測(cè)定，具體操作步驟按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體檢測(cè)方法見(jiàn)表1。

表1 血液生化指標(biāo)檢測(cè)方法

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，組間差異顯著性采用one-way ANOVA進(jìn)行分析，測(cè)定指標(biāo)與NEFA、BHBA的相關(guān)性采用Bivariate Correlations皮爾遜檢驗(yàn)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

利用SPSS 19.0-ROC-Curve程序建立ROC曲線，比較各指標(biāo)曲線下面積（Auc），并導(dǎo)出各指標(biāo)分析結(jié)果中的敏感度和1-特異度值至Excel，利用公式：約登指數(shù)（Youden）＝敏感度-（1-特異度），計(jì)算YI最大值，其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)值即為cutpoint，其中Se表示正確判斷病牛的比率，Sp表示正確判定非病牛的比率，Se越高表明漏診幾率越小，Sp越高表明誤診概率越小。本研究以Se大于等于0.70作為具有診斷意義的可能下限。Auc＞0.5時(shí)，其值越大表明該指標(biāo)的診斷準(zhǔn)確性越高；Auc＜0.5時(shí)，則表明該指標(biāo)無(wú)實(shí)際診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥發(fā)病率調(diào)查 如圖1所示，從產(chǎn)前21 d奶牛低血糖發(fā)病率逐漸增加，分娩當(dāng)天達(dá)到發(fā)病高峰（81.5%），產(chǎn)后逐漸降低，但至產(chǎn)后3周仍保持40%的發(fā)病率。

圖1 圍產(chǎn)期奶牛低血糖癥發(fā)病率調(diào)查

2.2 圍產(chǎn)期低血糖癥奶牛血液生化指標(biāo)的改變及其與NEFA、BHBA相關(guān)性分析 從表2可知，與健康奶牛相比圍產(chǎn)期低血糖奶牛NEFA、BHBA、AST顯著升高 （P＜0.05或0.01），GLU和Ca顯著降低（P＜0.05或0.01），其他指標(biāo)改變不大（P ＞ 0.05）。圍產(chǎn)期低血糖奶牛 GLU（r＝-0.597，P＝0.005）、Ca（r＝-0.490，v＝0.028）與 NEFA 呈顯著負(fù)相關(guān)，BHBA（r＝0.632，P＝0.003）與 NEFA 呈顯著正 相 關(guān)，GLU （r＝-0.629，P＝0.004）、NEFA （r＝-0.632，P＝0.003）與 BHBA 呈顯著負(fù)相關(guān)， AST（r＝0.704，P＝0.001）與 BHBA 呈顯著正相關(guān)。

2.3 高相關(guān)性血液生化指標(biāo)在奶牛低血糖癥診斷中的效用評(píng)價(jià)及參數(shù)確定 如圖2，表3所示，利用ROC曲線分析，在奶牛低血糖癥診斷中高相關(guān)性血液生化指標(biāo)的Auc分別為NEFA（0.721）、BHBA （0.674）、TG （0.621）、TBIL （0.351）、DBIL（0.459）、IBIL （0.319）、AST （0.522）、LDH （0.440）、Ca（0.018），其中 NEFA、BHBA、TG、AST 的 Auc面積大于0.5，具有診斷價(jià)值，利用Youden指數(shù)計(jì)算 cut-point 值 分 別 為 ：NEFA （Se∶0.642;1-Sp∶0.100）0.44mmol/L；BHBA （Se∶0.868;1-Sp∶0.500）0.34mmol/L；TG（Se∶0.472;1-Sp∶0.200）0.19mmol/L；AST（Se∶1.0;1-Sp∶1.0）53.00 IU/L。

表2 低血糖癥奶牛血液生化指標(biāo)與NEFA、BHBA的相關(guān)性分析（n=53）

圖2 部分血液指標(biāo)對(duì)奶牛低血糖癥診斷的ROC曲線比較

表3 部分血液指標(biāo)在奶牛低血糖癥診斷中的靈敏度、1-特異度和臨界點(diǎn)

3 討論

對(duì)圍產(chǎn)期低血糖奶牛發(fā)病率做了調(diào)查，顯示產(chǎn)前3周至分娩當(dāng)天發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，分娩當(dāng)天發(fā)生率最高，為81.5%，產(chǎn)后發(fā)生率逐漸降低至40%，仍保持較高發(fā)生率。說(shuō)明奶牛在圍產(chǎn)期存在能量負(fù)平衡，與采食量下降，干物質(zhì)攝入較少，能量來(lái)源不足致使葡萄糖（GLU）濃度下降有關(guān)。夏成等（2006）應(yīng)用半定量RT-PCR方法測(cè)定了圍產(chǎn)期奶牛PEPCK-C mRNA的豐度，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前奶牛低血糖的發(fā)生與肝PEPEK-C mRNA豐度低有關(guān)，胰島素可抑制PEPCK-C轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，降低PEPCK-C基因的表達(dá)，減少肝糖異生。

圍產(chǎn)期低血糖奶牛與健康奶牛相比，NEFA差異顯著，表明低血糖組奶牛存在脂肪動(dòng)員，使血液NEFA濃度升高。圍產(chǎn)期低血糖奶牛GLU（r＝-0.597，P＝0.005）、Ca （r＝-0.490，P＝0.028）與NEFA呈顯著負(fù)相關(guān)，表明在圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡易發(fā)生低血糖及低鈣血癥。圍產(chǎn)期低血糖奶牛BHBA（r=0.632，P=0.003）升高，且與 NEFA 呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明低血糖奶牛發(fā)生能量負(fù)平衡。圍產(chǎn)期低血糖奶牛GLU（r=-0.629，P=0.004）、NEFA（r=-0.632，P=0.003）與 BHBA 呈顯著負(fù)相關(guān)，AST（r=0.704，P=0.001）與 BHBA 呈顯著正相關(guān)，表明高BHBA與肝損傷有關(guān)。利用ROC曲線分析，在奶牛低血糖癥診斷中高相關(guān)性血液生化指標(biāo)篩選出具有診斷價(jià)值的指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)，妊娠后期奶牛肝臟葡萄糖凈通量為零，甚至為負(fù)數(shù)，泌乳初期肝臟葡萄糖總輸出量升高至妊娠后期的2.6倍，肝臟的糖異生作用在此起了最主要作用 （Piepenbrink， 等2003；Bell，1995）。血糖在機(jī)體中的代謝主要由神經(jīng)內(nèi)分泌激素等調(diào)控，常見(jiàn)的有胰島素、胰高血糖素、腎上腺素、糖皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素等（Bell，1995）。 當(dāng)血糖濃度下降，胰高血糖素分泌增加，胰島素分泌減少，腎上腺素增加，機(jī)體對(duì)糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝狀態(tài)主要體現(xiàn)在血糖的含量變化上。胰島素升高可幫助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，降低細(xì)胞中cAMP的濃度，加強(qiáng)糖原的合成。胰島素與胰高血糖素比值的升高，可以表明機(jī)體合成代謝加強(qiáng)。隨著奶牛即將分娩生理狀態(tài)發(fā)生劇烈變化來(lái)適應(yīng)分娩及泌乳需要，機(jī)體需要消耗大量的糖貯備，所以血糖呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

圍產(chǎn)期奶牛普遍存在低血糖，產(chǎn)前發(fā)病率高于產(chǎn)后。血糖濃度是低血糖癥的特異性指標(biāo)，血液TBIL、DBIL、IBIL、AST、TG、LDH、Ca、P 可 作 為 低血糖癥的輔助性指標(biāo)。本研究初步確定了低血糖癥輔助性指標(biāo)的cut-point，為低血糖的監(jiān)測(cè)提供了參考數(shù)據(jù)。