馬冬伍

(沈陽市沈北新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110121)

對(duì)氧磷酶(paraoxonase,PON)基因家族有三個(gè)成員,包括PON1、PON2和PON3。其中PON1也稱作血清對(duì)氧磷酶，它是一種廣譜非專一性脂酶,可以水解有機(jī)磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸脂等，重要的是具有抗氧化損傷、脂質(zhì)過氧化及參與抵御外來毒性的作用。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血清對(duì)氧磷酶主要由肝臟分泌，分布于血液、肝臟、脾臟及腦組織等，血清中PON1與高密度脂蛋白(HDL)緊密結(jié)合從而發(fā)揮功能。而反芻動(dòng)物卵泡液中的HDL是主要脂質(zhì)體蛋白，它是與PON1結(jié)合后由血液循環(huán)進(jìn)入卵泡的。由于PON1在胚胎早期發(fā)育過程中的抗氧化性，使得PON1在卵泡液中的活性與胚胎發(fā)育有直接的關(guān)系，因?yàn)榛钚匝?ROS)的產(chǎn)生與抗氧化作用之間平衡是胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。因此，對(duì)PON1的檢測(cè)可能作為動(dòng)物繁殖能力的一個(gè)標(biāo)記，本文對(duì)小尾寒羊血清和卵泡液中的PON1進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了血清中PON1濃度與繁殖力之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)羊的準(zhǔn)備

選擇雌性小尾寒羊 55只，56.4±1.1 Kg，22±3.5 月齡，所有羊經(jīng)過驅(qū)蟲、免疫，體格健壯，無生殖系統(tǒng)疾病等。所有羊只圈養(yǎng)，按照國家標(biāo)準(zhǔn)“小尾寒羊飼養(yǎng)方法DB22/T 917-1998”進(jìn)行飼養(yǎng)和管理。

1.2 血清采集與卵泡液準(zhǔn)備

隨機(jī)選擇50只羊作為試驗(yàn)羊，5只作為對(duì)照，不進(jìn)行任何處理。用自制醋酸甲羥孕酮海綿栓處理，放栓當(dāng)天為第1天，第14 天傍晚撤栓；從第1天開始，隔天采集所有羊只外周靜脈血，離心收集血清，直到第17天。第15天早上到第17天傍晚部分發(fā)情的羊只用于子宮頸口輸精，剩下羊只于第17天屠宰，分離雙側(cè)卵巢，在無菌條件下采用抽吸法抽取卵泡液，收集上清液，于低溫保存。輸精30 d后用超聲波診斷儀進(jìn)行妊娠診斷。

1.3 PON1檢測(cè)

確定對(duì)硝基酚吸收光譜與摩爾吸光系數(shù)，先配制對(duì)硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行連續(xù)系列稀釋后,測(cè)定中間有代表性的標(biāo)準(zhǔn)液在不同波長下的吸光值,確定最大吸收峰，從而在該吸收峰情況下再測(cè)定其他濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定PON1活性時(shí)，酶促反應(yīng)緩沖液保護(hù)含0.4 mol/L甘氨酸、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L對(duì)氧磷、pH =10，樣品為10 L。在羅氏MODULARP800全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行樣品測(cè)定，PON1活性根據(jù)如下公式計(jì)算 ：PON(U/ml)=ΔA /min×TV×103/(ε×SV×L )。其中ΔA/min為每分鐘吸光度變化值，TV為反應(yīng)總體積(ml)，SV為樣本體積(ml), L為比色杯光徑(1 cm), 103是將mol換算成mol的系數(shù)，?為對(duì)硝基酚的摩爾消光系數(shù)(cm2/mol)。同時(shí)用生理鹽水進(jìn)行陰性對(duì)照。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 卵泡大小與PON1活性關(guān)系試驗(yàn) 屠宰的羊只，分離卵巢，無菌條件下計(jì)算卵泡總數(shù)，用微標(biāo)卡尺測(cè)量卵泡直徑，直徑小于4 mm的卵泡為小型卵泡，直徑在5～12 mm的為可用卵泡，而大于13 mm的為大卵泡，抽吸卵泡液，每一只羊各種類型的卵泡液集中在一起，離心后待測(cè)定。

1.4.2 卵泡液中PON1與外周血PON1活性關(guān)系測(cè)定 將從第1天至17天隔天采集的血液以600 r/min離心5 min，去掉底部沉淀，收集上面的血清，每只羊每次血清單獨(dú)存放，待用。

1.4.3 外周血PON1活性與繁殖能力之間關(guān)系試驗(yàn) 屠宰后剩下的表現(xiàn)發(fā)情的羊只，用來自同一公羊的冷凍精液進(jìn)行人工輸精，隔12 h后再輸精1次。觀察第1個(gè)情期返情羊只，30 d后進(jìn)行妊娠診斷，最后記錄、分析產(chǎn)羔率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 所有結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用廣義線性模型分析不同類型卵泡直徑和PON1濃度的變化差異，采用線性回歸模型驗(yàn)證血清與卵泡液中PON1關(guān)系及血清PON1與繁殖力之間的關(guān)系。用單因素方差分析發(fā)情率、返情率、妊娠率及產(chǎn)羔數(shù)，P<0.05為差異顯著，而P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同類型卵泡之間 PON1活性比較

根據(jù)綿羊卵泡體外培養(yǎng)特點(diǎn)，將卵泡分為小、中、大三種類型，大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小型卵泡屬于無用卵泡，無論是分離卵母細(xì)胞還是卵泡直徑培養(yǎng)，都逐漸走向凋亡；中型卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞是目前最具有發(fā)育能力的，而大型卵泡一般都是發(fā)育異常的，其中的卵母細(xì)胞發(fā)育能力低下。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，大型卵泡內(nèi)PON1活性和小型卵泡相比差異不顯著，而兩者顯著低于中型卵泡內(nèi)的PON1活性。

2.2 血清中PON1活性與發(fā)情表現(xiàn)之間的關(guān)系

圖1 卵泡大小與PON1活性之間關(guān)系

圖2 同期發(fā)情處理期間血清中PON1活性變化

從放栓當(dāng)天開始采集外周血，檢測(cè)血清中PON1活性，第14 d傍晚撤栓，第15 d早上開始用公羊試情，有發(fā)情表現(xiàn)的羊進(jìn)行輸精，在第17 d屠宰3只非發(fā)情羊和8只發(fā)情羊。從圖2中可以看出，未表現(xiàn)發(fā)情的羊只血清PON1與未加任何處理的對(duì)照組羊相比，無顯著差異，而兩者現(xiàn)在低于具有發(fā)情表現(xiàn)的羊；對(duì)照組羊血清PON1幾乎無變化。

2.3 卵泡液與血清PON1關(guān)系

由于對(duì)卵泡液的檢測(cè)比較困難，如果能確定血清中PON1的活性與卵泡中的關(guān)系，那么今后就可以直接檢測(cè)血清中的PON1就可以判定卵泡的功能。因此，對(duì)屠宰的8只表現(xiàn)發(fā)情的羊只血清PON1平均值與其相應(yīng)的卵泡液中PON1進(jìn)行比較，從圖3可以發(fā)現(xiàn)，8只表現(xiàn)發(fā)情的羊卵泡中的PON1與其血清中的PON1成正相關(guān)，且相關(guān)性極強(qiáng)。

2.4 血清PON1與繁殖力之間的關(guān)系

圖3 卵泡液與血清中PON1相關(guān)性分析

圖4 不同產(chǎn)羔數(shù)母羊血清PON1比較

同期發(fā)情處理50只羊，發(fā)情率為94.0%，人工輸精后第一個(gè)情期返情率為4.4%，妊娠率為95.6%，而妊娠期間2只羊出現(xiàn)不明原因的流產(chǎn)。最終分娩率為95.6%，分娩后產(chǎn)單羔率為46.7%，雙羔率為44.4%，三羔率為4.4%，因此，總產(chǎn)羔率為155.8%。另外，從圖4可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)雙羔和產(chǎn)三羔母羊之間血清PON1無顯著性差異，產(chǎn)單羔母羊血清PON1活性與全部羊群血清PON1平均值之間無顯著性差異，但是顯著低于產(chǎn)雙羔和產(chǎn)三羔母羊血清PON1值。

3 討論

PON1在血液循環(huán)過程中與高密度脂蛋白(HDL)緊密結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞、脂質(zhì)體及低密度脂蛋白(LDL)避免過氧化物的損傷作用。而在卵泡液中的蛋白以HDL為主，因此，PON1在卵泡的發(fā)育成熟過程中具有重要意義。迄今，國內(nèi)關(guān)于PON1活性與綿羊繁殖力之間關(guān)系的研究從未見報(bào)道。國內(nèi)目前多數(shù)采用ELISA方法對(duì)人外周血PON1進(jìn)行檢測(cè)定量，其利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，成本較高，尤其是對(duì)于本實(shí)驗(yàn)樣品較多，需要花費(fèi)更多的人力財(cái)力。因此，我們檢測(cè)PON1的原理是PON1可以催化對(duì)氧磷水解產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基酚，而對(duì)硝基酚在412 nm處有最大吸收峰，可以通過測(cè)定酶促反應(yīng)時(shí)吸光度的變化來反映酶活性。因此，對(duì)硝基酚的量可反映PON1的活性，本試驗(yàn)過程中采用速率法進(jìn)行檢測(cè)，試劑自己配制，相對(duì)而言經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，也是國外多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的方法。

試驗(yàn)根據(jù)(Lundy T，et al.,1999)對(duì)屠宰的羊卵泡進(jìn)行分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵泡大小與PON1活性之間有一定的關(guān)系，可用卵泡PON1活性平均值為180.1±5 U/ml，但是小型和大型卵泡內(nèi)PON1都過低，初步說明PON1在卵泡液中的抗氧化功能過低不利于其發(fā)育分化。同期發(fā)情處理后，表現(xiàn)發(fā)情的羊外周血中的PON1活性顯著高于非發(fā)情羊只和未進(jìn)行同期處理的羊只，并且，在同期處理期間，PON1上升趨勢(shì)比較明顯，雖然未表現(xiàn)發(fā)情的羊血清PON1也具有上升的趨勢(shì)，但是仍不足以維持發(fā)情的需要，也就是仍然低于發(fā)情需要的閾值。說明綿羊發(fā)情前PON1活性必須高于這個(gè)閾值才能正常輸精，說明而同期處理后未表現(xiàn)發(fā)情的羊與較低的PON1活性有關(guān)。

在進(jìn)行卵泡液PON1與血清PON1之間的關(guān)系分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)屠宰的8只發(fā)情羊卵泡液PON1活性普遍低于血清中的活性，并且他們之間呈現(xiàn)線性關(guān)系(r2=98, P=0.0001)，因此，基本可以用外周血PON1活性代替卵泡液中的PON1。Pradieé等(2007)采用試劑盒對(duì)牛外周血清和卵泡液中的PON1進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)血清中的PON1活性普遍比卵泡液中的高2-3倍 ，并且通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PON1基因不在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，說明卵泡液中的PON1來源于血液循環(huán)，這與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果基本一致。

此外，小尾寒羊?yàn)楦弋a(chǎn)品種，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)雙羔和三羔的羊外周血中的PON1要顯著高于產(chǎn)單羔的羊，而前兩者之間差異不顯著；并且所有羊群的PON1平均值與產(chǎn)單羔羊之間差異也不顯著。說明根據(jù)外周血中的PON1活性可以初步判斷羊只的羊只妊娠、分娩情況，尤其是對(duì)是否產(chǎn)雙羔或三羔具有較準(zhǔn)確的判斷。

因此，在對(duì)小尾寒羊進(jìn)行同期發(fā)情處理后，卵泡直徑大小與PON1活性有較大的相關(guān)性，卵泡直徑過大或過小會(huì)導(dǎo)致卵泡液中的PON1活性過強(qiáng)或過弱，都不利于隨后的受精；具有發(fā)情表現(xiàn)的羊外周血清中PON1要顯著高于無發(fā)情表現(xiàn)的羊只；正常的具有發(fā)情表現(xiàn)羊只卵泡液中的PON1與其外周血相比，具有極強(qiáng)的相關(guān)性，說明卵泡液中的PON1來源于外周血液循環(huán)；此外，根據(jù)外周血液中的PON1活性可以基本判斷該羊輸精后能否妊娠，是否產(chǎn)雙羔或三羔。該結(jié)果可以提高綿羊輔助生殖技術(shù)的成功率，對(duì)促進(jìn)肉羊快繁具有現(xiàn)實(shí)意義。