近年來，國內(nèi)外研究者針對人骨髓基質(zhì)干細胞(human bone marrow strom al cells，HBMSCs)向神經(jīng)細胞系分化的體內(nèi)外誘導移植實驗研究結(jié)果均證實干細胞移植治療的可行性。2017年新的實驗研究MASTERSⅡ期臨床實驗研究對發(fā)病后24 h～36 h接受干細胞移植治療的病人隨訪1年，實驗統(tǒng)計結(jié)果提示干細胞移植治療的病人存在臨床獲益。這項實驗研究進一步為急性缺血性腦損傷的干細胞移植臨床治療提供了確切的依據(jù)，成為2017年神經(jīng)病學領(lǐng)域新的成就與突破點，為降低急性缺血性腦損傷致殘率，減輕致殘后社會經(jīng)濟負擔帶來了新的曙光。干細胞移植治療，關(guān)鍵在于干細胞體外培養(yǎng)分化的滿意度，是移植治療的前提，因此干細胞研究者們對于HBMSCs體外誘導分化的最佳因子、外部條件影響因素的探索試驗尤其重視和期盼。目前體外誘導實驗研究主要為使用各種外來因子、化學試劑對HBMSCs進行誘導調(diào)控，例如：國內(nèi)學者臨床治療急性腦梗死應(yīng)用清除自由基劑依達拉奉、丁苯酞，以及神經(jīng)修護因子神經(jīng)節(jié)苷脂、胞二磷膽堿及神經(jīng)生長促進劑葉酸、甲鈷胺等，還有中藥制劑丹參、銀杏葉、紅花、黃芪等作為誘導劑[1-2]。

還原型谷胱甘肽(reduced glutathione GSH)是谷胱甘肽在體內(nèi)的氧化活性成分，多項研究均提示GSH具有抗炎、抗氧化、清除自由基等細胞保護作用。在臨床多用于急性肝損傷、腎臟損傷的治療。也有學者研究發(fā)現(xiàn)GSH在預(yù)防血管性認知障礙、帕金森等領(lǐng)域有較顯著的治療效果。GSH和維生素C(vitamin C，VC)液均為體內(nèi)主要的自由基清除劑，GSH的作用主要是使其巰基-SH氧化，而VC能夠維持活性成分巰基-SH處于還原狀態(tài)，進一步影響細胞的代謝過程。王蘭等[3]研究證實大鼠骨髓基質(zhì)干細胞可以在GSH作用下成功誘導出神經(jīng)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)mRNA的表達。本研究擬通過GSH聯(lián)合VC液共同作用下骨髓基質(zhì)干細胞分化的實驗，觀察VC液是否可以促進GSH發(fā)揮抗氧化神經(jīng)保護作用，進一步探討GSH、VC液對HBMSCs體外誘導的作用機制。

1 材料與方法

1.1 干細胞來源 門診健康志愿者。

1.2 主要試劑 GSH(上海復(fù)旦夏華藥業(yè)股份有限公司)，L-DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生物制劑公司)，VC液(北京雙鶴藥業(yè)有限公司)，胎牛血清(北京普利萊生物有限公司)，羊抗小鼠二抗(天津景晨生物制品公司)，谷氨酰胺(武漢普諾賽生物制劑公司)，EDTA(天津景晨生物制品有限公司)，甲基亞砜(DMSO，武漢普諾賽生物制劑公司)，小鼠抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)單抗(Chemical公司)，GFAP單抗(Chemical公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HBMSCs分離與培養(yǎng) 穿刺取健康志愿者骨髓4 mL并肝素化，均分至50 mL培養(yǎng)瓶。加入培養(yǎng)基搖勻，培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細胞至90%以上融合時準備傳代。顯微鏡下觀察，細胞體開始回縮后終止消化。用吸管輕輕反復(fù)吹打瓶底至細胞完全脫落，按1∶3分瓶培養(yǎng)。取第5代細胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗制成單細胞PBS懸液300 μL，均分至5只Ef管，每份標本計數(shù)10 000個細胞，取四管，一管做空白對照，余三管依次加入CD90、CD45、CD105。4 ℃，避光，培育30 min。PBS沖洗1遍，放入冰盒，避光，進行流式細胞儀檢測，結(jié)果取3次均值。

1.3.2 HBMSCs的體外誘導分化 取第5代HBMSCs，接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)成單層細胞后進行預(yù)誘導。培養(yǎng)液仍為L-DMEM，分4組，每組均以1 mmol/L BME作為預(yù)誘導液預(yù)處理24 h。更換培養(yǎng)液，并PBS洗滌3次，以DMSO+BHA+DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)作為對照組。在此基礎(chǔ)上分別加入10 mmol/L GSH 10 μL、VC液、GSH+VC液10 μL誘導液處理進行誘導分化，作為GSH組、VC液組、GSH+VC組。

1.3.3 免疫組化法鑒定及計數(shù)細胞 預(yù)制備細胞爬片后取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水洗滌，干燥后加入0.5%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min，PBS洗滌，5%正常羊血清封閉20 min，分別加入含抗NSE、GFAP單克隆抗體作為第一抗體。37 ℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌3次。滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG，37 ℃反應(yīng)20 min，PBS洗滌3次，加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑，37 ℃反應(yīng)20 min，PBS 洗滌4次。最后用新配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液在室溫反應(yīng)5 min～30 min，顯微鏡下監(jiān)測其顏色變化，陰性對照不加一抗。細胞分化率計算公式：(NSE+GFAP)陽性染色細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 HBMSCs的分離與擴增 接種后24 h顯微鏡觀察，少許細胞貼壁，多為橢圓形，成對出現(xiàn)，折光性強。繼續(xù)培養(yǎng)2 d～3 d，可見少數(shù)多邊形、梭形細胞，個別胞體見不同方向細胞突起。5 d后胞體進一步增大，第8天可見集落生長的細胞群。進行傳代后第2天細胞即貼壁生長，5 d左右即鋪滿瓶底，5代的細胞形態(tài)比較均一。

2.2 流式細胞儀鑒定結(jié)果、細胞形態(tài)變化 HBMSCs經(jīng)流式細胞儀測定表面標記結(jié)果為CD90(+)、CD105(+)、CD45(-)，表明細胞純度相對較高。經(jīng)GSH、VC液及兩者混合液分別誘導分化后14 h，每組細胞胞體均成圓形分化，并有局部胞體不同程度突起，隨著時間延長突起變多變長，并相互連接交織成網(wǎng)。

2.3 免疫細胞化學鑒定及分化細胞的計數(shù) 誘導分化后14 h，每組細胞胞體均成圓形分化，并有局部包體不同程度突起，折光性強；誘導后24 h行細胞免疫化學顯示，對照組、VC液組以GFAP陽性為主；GSH組、GSH+VC組以NSE陽性為主。GSH+VC組NSE、GFAP陽性表達率與GSH組、VC液組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 HBMSCs誘導分化后神經(jīng)性細胞特異性抗原表達率(±s) %

3 討 論

目前腦卒中的治療多限于急性期靜脈溶栓、靜脈動脈橋接治療及丁苯酞、尤瑞克林側(cè)支循環(huán)的改善，以及其他腦保護及清除自由基等治療。國內(nèi)外研究者已經(jīng)證實在大鼠腦缺血后數(shù)小時HBMSCs 移植治療即可挽救缺血半暗帶神經(jīng)細胞的代謝、清除自由基，使神經(jīng)功能不同程度改善[4-6]。移植治療HBMSCs后組織冰凍切片及磁共振磁共振彌散成像(DWI)與增強灌注成像(PWI)均顯示細胞損傷明顯減輕[7-9]。HBMSCs 這些積極的作用機制包括神經(jīng)細胞保護作用，二級、三級新生血管生成，神經(jīng)元再生和軸突發(fā)芽、樹突再生[4，10-11]。

本實驗結(jié)果顯示，GSH、VC液及其混合液均能促進HBMSCs向神經(jīng)元細胞增殖傳代及分化，其中GSH+VC組增殖分化較為理想，明顯高于GSH組、VC液組。提示GSH在適當劑量VC液的誘導下對神經(jīng)細胞分化的影響較單一GSH誘導分化效果更佳，證實了VC可以促進GSH清除自由基、神經(jīng)保護等作用。目前因為我國關(guān)于急性卒中腦梗死病人院前宣傳效果不佳，很多病人發(fā)生急性神經(jīng)缺失癥狀后就診時大部分已錯過急性靜脈溶栓時間，甚至錯過動脈橋接時間，很多病人只能進行靜脈營養(yǎng)治療，因此對諸多神經(jīng)保護劑療效的探索尤為重要，本實驗旨在為GSH臨床治療中改善病人神經(jīng)缺失癥狀提供更多依據(jù)，可以適量GSH、VC聯(lián)用發(fā)揮更好療效。