郭剛 王威 朱捷 祖強 張旭

1中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科 100853 北京

結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)是一組常染色體顯性遺傳并累及三個胚層多種器官的綜合征，其在新生兒的發(fā)病率約為1/5 800，總患病率約為1/12 500。其主要由TSC1和TSC2基因失活性突變所致，特征性臨床表現(xiàn)為面部血管纖維瘤、癲癇、智力低下三聯(lián)征，病變隨年齡增長逐漸進(jìn)展[1]。文獻(xiàn)報道，約10%的腎臟血管平滑肌脂肪瘤(angiomyolipoma, AML)患者合并有TSC，而TSC患者中超過80%合并有腎臟AML。與散發(fā)性腎臟AML，TSC相關(guān)的腎臟AML多表現(xiàn)為雙側(cè)多發(fā)，易出現(xiàn)出血、腎衰竭等嚴(yán)重后果[2]。2012版國際TSC專家共識給出的TSC診斷標(biāo)準(zhǔn)包括臨床診斷和基因診斷兩部分，并將基因診斷作為獨立的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。既往的一代測序技術(shù)雖然費用低廉，但一部分突變無法檢出，也無法明確所檢測到的突變是否具有致病性[4]。我們對47例臨床診斷為TSC相關(guān)AML的患者和32例散發(fā)性腎AML患者應(yīng)用一代測序PCR-SSCP和目標(biāo)序列捕獲二代測序技術(shù)(NGS)進(jìn)行TSC1/2基因突變檢測，對比兩者在基因診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入2015年1月～2017年6月在我院臨床診斷為結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)AML患者共47例作為研究對象，其中男11例，女36例，平均32.1歲(18～50歲)。其中11例患者來自7個家系。另有32例為散發(fā)性腎血管平滑肌脂肪瘤，其中男12例，女20例，平均34.2歲(26～53歲)。所有患者均行增強CT或MRI檢查明確腫瘤大小、位置、數(shù)量及主要成分構(gòu)成。所有患者均表現(xiàn)為雙腎多發(fā)血管平滑肌脂肪瘤，瘤體平均最大直徑9.6 cm(4～30 cm)，其中有2例患者病理證實為惡性腎血管周上皮樣細(xì)胞腫瘤。依據(jù)2012版結(jié)節(jié)性硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)記錄患者的一般情況、遺傳信息、既往病史(是否癲癇發(fā)作等)、體格檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查及其他輔助檢查結(jié)果，詳見表1。

1.2 檢測方法

1.2.1一代測序 ①血樣采集：臨床血樣來源于在解放軍總醫(yī)院就診的79例臨床診斷為腎臟AML的患者。采用EDTA抗凝管收集患者外周靜脈血5ml，檢測前在4°C冰箱內(nèi)保存48 h，血樣采集獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并簽署知情同意書。②基因突變分析：分離外周血白細(xì)胞，按照DNA提取試劑盒(QIAampDNA Blood Midi Kit, Qiagen, 希爾登, 德國)操作說明提取血液基因組DNA 。所有TSC1 和TSC2 的外顯子應(yīng)用相鄰的基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用SSCP法(single-strand conformation polymorphism)進(jìn)行基因突變分析。突變基因采用DNA測序方法進(jìn)行復(fù)核。共檢測TSC1基因21個外顯子和TSC2基因41個外顯子。記錄所有患者的基因突變發(fā)生情況。

表1 患者基本信息

1.2.2目標(biāo)序列捕獲二代測序 ①目標(biāo)序列捕獲與測序：抽取受試者及對照者靜脈血5ml，標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany)。利用Covaris LE220超聲波儀(Massachusetts, USA)將基因組DNA打斷成200～250 bp的片段，隨后進(jìn)行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng)，從而完成單個受檢者的DNA建庫。Non-Captured樣品進(jìn)行LM-PCR反應(yīng)，純化，利用定制的基因片段捕獲探針 (BGI自主探針)， 65℃雜交捕獲24h，雜交結(jié)束后進(jìn)行探針的洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進(jìn)行Captured樣品的LM-PCR反應(yīng)。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI StepOne進(jìn)行片段大小、濃度的檢測，最后利用高通量測序儀Illumina HiSeq2500 Analyzers(Illumina，SanDiego，USA)連續(xù)雙向測序90個循環(huán)，用Illumina Pipeline software(version 1.3.4)讀出原始測序數(shù)據(jù)。②序列分析：數(shù)據(jù)下機后進(jìn)入信息分析部分。首先對下機的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行測序質(zhì)量評估，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的讀數(shù)。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)與HG19進(jìn)行序列比對，與此同時進(jìn)行序列捕獲效果評價，用SOAPsnp軟件和Samtools軟件分別進(jìn)行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)的查詢，生成目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比對，并對找出的可疑突變進(jìn)行注釋、篩選。③Sanger法驗證：對于所有發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上下游設(shè)計引物。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物做Sanger測序，所得結(jié)果與TSC1/2基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，從而驗證探針捕獲和高通量測序的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 一代測序

共檢測TSC1基因21個外顯子和TSC2基因的41個外顯子，66例(83.5%)患者檢測到TSC1或TSC2基因突變，其中TSC1共19例，TSC2共29例，兩者同時突變18例；其中結(jié)節(jié)性硬化組40例(85.1%) ，散發(fā)組26例(81.3%)檢測到基因突變(P>0.05)。未檢測到基因突變13例。具體突變位點包括：TSC1:Exon5/23(各4例)，Exon7/13/17/18/22(各3例)，Exon15/34/8/12/16(各2例)，Exon6/14/19/20(各1例)； TSC2:Exon6/17/33/36(各4例)，Exon1/4/5(各3例)，Exon7/9/11/21/22/23(各2例)，Exon3/8/12/13/20/27/28/34/35/38(各1例)，詳見表2。

表2 兩組患者不同基因檢測結(jié)果對比

2.2 目標(biāo)序列捕獲二代測序

BWA軟件行序列捕獲效果評價顯示，所有樣本NGS平均堿基覆蓋度為99.88%，最低樣本覆蓋度為99.44%。目標(biāo)區(qū)域平均測序深度>30X位點所占比例平均值為98.92%，最低值為97.35%。所有樣本的平均測序深度為280.4X，最低測序深度為168.4X。而且TSCl和TSC2基因各外顯子上的平均測序深度與測序深度中位數(shù)均比較接近，表明目標(biāo)序列捕獲二代測序的隨機性較好。

39例(49.4%)患者檢測到TSC1或TSC2基因突變，其中TSC1 6例，TSC2 31例，兩者同時突變2例，其中結(jié)節(jié)性硬化組34例(72.3%)，散發(fā)性組5例(15.6%)檢測到基因突變，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。共鑒定出32種突變，包括5種無義突變，7種框移突變，8種錯義突變，4種大片段缺失突變和4種剪接突變，3種點突變，1例插入突變。另有2例患者鑒定出臨床意義未明的非同義突變 ，是分別位于TSCl基因第34號外顯子的C.26247G>C非同義變和位于TSC1基因引導(dǎo)區(qū)的C.2640G>T非同義突變。此外，還有8例臨床診斷為TSC的患者未能檢測到TSCl或TSC2基因的任何突變(表3)。87.18%的基因突變均位于TSCl或TSC2基因外顯子區(qū)域，47例患者中總的突變檢出率為72.3%。

通過對比以往文獻(xiàn)及LOVD數(shù)據(jù)庫MJ[5]，共有4個臨床意義未明確的突變和2個未報道突變。4個臨床意義未明確突變中：TSC2外顯子18的C.1939G>A錯義突變和TSC1外顯子15的C.1700C>T錯義突變患者的臨床特征無法確診為TSC；而位于TSC2外顯子30的C.3610G>A錯義突變，位于TSC1的C.*1717-55T>C錯義突變以及位于TSC2的C.*2626-4delT大片段缺失突變患者為TSC臨床確診病例。而2個新發(fā)現(xiàn)突變分別位于TSC2基因的C.-29-6G>A剪切突變和位于TSC1外顯子15的C.1916G>T錯義突變，兩名患者的臨床特征均未能確診為TSC。

2.3 Sanger測序驗證

應(yīng)用常規(guī)Sanger測序?qū)?3例NGS檢測到30種突變位點進(jìn)行驗證，其結(jié)果與目標(biāo)序列捕獲測序結(jié)果完全一致，符合率100%。此外，對于4例大片段基因缺失的患者。采用定量PCR進(jìn)行驗證，結(jié)果與NGS一致。

3 討論

TSC是以錯構(gòu)瘤為主要表現(xiàn)的累及多個系統(tǒng)和器官的常染色體顯性遺傳性疾病，TSC1和TSC2兩個腫瘤抑制基因是該病的致病基因。TSC1基因含有23個外顯子，第1、2外顯子不具有編碼功能，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量為8.6的mRNA，編碼相對分子質(zhì)量為1.3×105，由164個氨基酸組成的錯構(gòu)瘤蛋白。TSC2基因含有41個編碼外顯子和1個無編碼意義的引導(dǎo)外顯子，轉(zhuǎn)錄為相對分子質(zhì)量為5.5的mRNA，編碼相對分子質(zhì)量為2×105，由1807個氨基酸組成的馬鈴薯球蛋白(tuberin)。上述兩種蛋白可形成一種復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長、黏附及囊泡運輸?shù)萚6, 7]。對于TSC的患者進(jìn)行基因檢測，可有75%～85%的患者檢測到TSC1或TSC2基因的突變，且大部分突變發(fā)生在TSC2基因上，約占總突變檢出率的82%[8, 9]。TSC是一種表型多樣的疾病，Dabora等曾經(jīng)對224名TSC患者進(jìn)行突變檢測發(fā)現(xiàn)，TSC2基因發(fā)生突變的患者臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重，較易發(fā)生智力發(fā)育遲緩、癲癇、面部血管纖維瘤及視網(wǎng)膜錯構(gòu)瘤等[10]。部分TSC1突變患者無陽性癥狀，要通過基因檢測方可診斷。因此早期基因診斷尤為重要。且仍有10%～25%患者尚未找到相應(yīng)的基因突變位點，突變規(guī)律、突變后信息傳遞過程仍在進(jìn)一步研究中，產(chǎn)前診斷、基因治療等臨床問題迫切需要解決，探索結(jié)節(jié)性硬化癥致病基因更快速、簡便的診斷方法刻不容緩[11]。

表3 39例經(jīng)二代測序檢測到的致病性TSC1/2基因突變情況

既往較常采用的基因檢測方法包括:變性高效液相色譜(DHPLC)法、DNA直接測序技術(shù)(DNA-sequencing)和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation．dependent probe amplification, MLPA)。DNA直接序法因靈敏度較低，操作復(fù)雜、耗時，常與DHPLC法、MLPA法聯(lián)用，甚至逐漸被改進(jìn)的DHPLC法、MLPA法所取代。DHPLC法及MLPA法均可同時檢測多個靶基因位點或突變片段，且智能化程度高，所需樣本量少，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于TSC致病基因篩查及實際臨床診治工作[12]。近年來，新的基因診斷技術(shù)如原子探針顯微鏡測序法、DNA芯片法及熒光SSCP測序技術(shù)等均開始應(yīng)用于TSC突變基因的檢測，大大提高了對TSC患者臨床診治工作的效率，也可為結(jié)節(jié)性硬化癥在分子遺傳學(xué)等方面的深入研究提供更好的平臺[13、14]。

目標(biāo)序列捕獲二代測序技術(shù)是一種高通量測序技術(shù)，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度及低運行成本等突出優(yōu)勢，與傳統(tǒng)測序技術(shù)相比，更加省時。相比于第一代測序技術(shù)，NGS采用反應(yīng)實時閱讀技術(shù)，顯著縮短了檢測時間，并可將測序費用降低幾個數(shù)量級。與傳統(tǒng)Sanger測序、PCR及定量PCR等檢測方式相比，NGS在全面解決多基因及遺傳異質(zhì)性疾病方面更具優(yōu)勢，可同時進(jìn)行多個樣本的檢測，而且對于SNV、缺失或重復(fù)的檢測準(zhǔn)確性更高。相比于MLPA和單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP-array)等相對高通量檢測技術(shù)，NGS不僅可檢測出已知的致病性突變，還可以發(fā)現(xiàn)新的突變位點，同時能避免上述技術(shù)檢測存在的基因SNP的種族差異性(假陰性)[15, 16]。隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，NGS 已越來越多的應(yīng)用于遺傳病的診斷中，并體現(xiàn)出相對傳統(tǒng)測序快速、準(zhǔn)確、低成本、高覆蓋度等優(yōu)勢。目前NGS 在遺傳病診斷應(yīng)用中主要有全基因組測序(whole genome sequencing, WGS) 、全外顯子測序(whole exon sequencing, WES)及靶向基因測序幾種[17]。靶向基因測序因僅需對與疾病密切相關(guān)的幾個或幾十個基因通過定制探針、芯片或PCR技術(shù)進(jìn)行特異性捕獲，性價比相對更高。應(yīng)用NGS技術(shù)，通過加深測序深度，不僅可以發(fā)現(xiàn)低比例的嵌合突變，同時也將很多的非編碼區(qū)進(jìn)行檢測。NGS技術(shù)不僅可以檢測點突變、微小插入或缺失，也可以通過算法得到大片段重復(fù)、缺失的結(jié)果，這些都有助提高TSC基因的陽性檢出率[18～20]。

本研究患者在接受PCR-SSCP基因測序中，盡管總體突變檢出率高于高通量二代測序，但是在TSC人群和散發(fā)性AML人群中檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其結(jié)果僅能定位于外顯子，缺少突變類型以及氨基酸變化等分析，直接影響到對致病性的分析。而在高通量二代測序中，在TSC患者中的突變率為72.3%，其中TSC2突變比例為84.6%，與既往文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)相近[21]。此次共檢測到32種突變，通過對比LOVD突變數(shù)據(jù)庫(http://chromium.liacs.nl/LOVD2 /TSC)，大部分突變?yōu)橐褕蟮劳蛔儯?個臨床意義未明確突變中：TSC2外顯子18的C.1939G>A錯義突變的臨床意義仍不能明確，TSC1外顯子15的C.1700C>T錯義突變患者病理確診為惡性腎血管周上皮樣細(xì)胞瘤，因此推測這一突變可能具有致病性。而位于TSC2外顯子30的C.3610G>A錯義突變，位于TSC1的C.*1717-55T>C錯義突變以及位于TSC2的C.*2626-4delT大片段缺失突變患者均符合TSC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此推測這兩個突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。?個新發(fā)現(xiàn)突變分別是位于TSC2基因的C.-29-6G>A剪切突變和位于TSC1外顯子15的C.1916G>T錯義突變，患者的臨床特征均未能確診為TSC，因此其臨床意義尚不明確。

綜上所述，隨著基因診斷廣泛應(yīng)用于TSC疾病的診斷，更加便捷、精準(zhǔn)、價廉的基因檢測手段將不斷涌現(xiàn)。通過對TSC1/2基因突變的深入分析，越來越多的致病基因?qū)⒈话l(fā)現(xiàn)，而基因突變與TSC臨床表型、藥物療效等的相關(guān)性也將逐步明晰。