滕爽，呂青骎，沈娟，包月紅，湯曉燕，王瑋*

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)，江蘇 南京，210095) 2(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，北京，100081)

磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)和氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)作為廣譜抗菌藥，主要用于預(yù)防和治療畜禽的感染性疾病，這兩類獸藥性質(zhì)穩(wěn)定、品種多、產(chǎn)量大、價格低、使用簡便，在獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑或動物疾病治療藥物被廣泛使用[1-2]。但在人工飼養(yǎng)過程中，如不當或超量使用這些藥物，會導(dǎo)致其殘留在動物性食品中，給人類健康帶來危害。因此，動物性食品中的獸藥殘留問題引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[3]。目前，我國對磺胺類和氟喹諾酮類藥物在動物體內(nèi)殘留也有相應(yīng)的限量規(guī)定[4]，如磺胺類在動物食品的肌肉、脂肪、肝、腎組織中總量不得超過100 μg/kg；恩諾沙星在肌肉中的限量為100 μg/kg。

目前，動物性食品中SAs或FQs獸藥殘留量的檢測方法主要有毛細管電泳法[5-6]、免疫法[7-9]、高效液相色譜法[10-15]以及液相色譜-質(zhì)譜法[16-19]等。其中，毛細管電泳法分離效率高，但重現(xiàn)性差；免疫法檢測速度快、靈敏度高、選擇性強，但一般只作為輔助手段；高效液相色譜法應(yīng)用廣泛，但分析時間長，有機溶劑使用量大；液相色譜-質(zhì)譜法可實現(xiàn)多種物質(zhì)的同時分析，但儀器價格較為昂貴。超高效液相色譜法(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)作為一種基于超高壓系和小顆粒填料色譜柱的新型的液相色譜技術(shù)，其結(jié)合后可明顯提高檢測靈敏度以及色譜峰的分離度，縮短樣品的檢測周期，還可實現(xiàn)分離難度大的復(fù)雜體系的快速分析，但其價格卻遠低于液質(zhì)聯(lián)用儀，這使得UPLC法在藥物分析、食品分析等領(lǐng)域備受關(guān)注[20-21]。為此，本試驗通過優(yōu)化前處理方法和儀器檢測條件，建立了一種UPLC技術(shù)同時檢測豬肉中的9種磺胺類和3種氟喹諾酮類藥物的方法，彌補常規(guī)檢測方法的缺陷，以期為我國動物性食品中獸藥殘留的高通量快速檢測以及食品安全法的順利實施提供可靠的科學(xué)支持和堅實的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為各種市售豬肉及制品，如生鮮豬肉、香腸、火腿腸、鹵肉等樣品，均購自南京農(nóng)貿(mào)市場和超市。

標準品：磺胺醋酰(sulphacetamide, SA)、磺胺噻唑(sulfathiazol, ST)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine, SM2)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxazole, SMP)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺二甲異惡唑(sulfisoxazole, SIZ)、磺胺二甲氧噠嗪(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺喹噁啉(sulfamethoxazole, SQ)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)、沙拉沙星(sarafloxacin, SAR)，均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購自美國Fisher公司；磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)(分析純)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)(分析純)，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；InerSep HLB小柱(200 mg/6mL)，購自日本島津公司；試驗中用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀(配有PDA、FLR檢測器)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，美國Waters公司；advance EDI純水儀、CPA224S電子天平、D-16C高速離心機，德國Sartorious公司；XS-105電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HS 501數(shù)顯型混勻器，德國IKA公司；N-EVAP 24管氮吹儀，美國Organomation公司；VISIPREP 24TMDL固相萃取裝置，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

(1)提取：稱取2 g K2HPO4·3H2O和8 g KH2PO4，一級水溶解并定容至1 000 mL，該溶液作為提取液(pH 6)。將樣品制成肉糜，準確稱取2.0 g樣品，置于50 mL離心管中，加入8 mL提取液，渦旋混勻，振蕩器振蕩30 min，8 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，在離心沉淀物中加入8 mL提取液，重復(fù)以上步驟，并將2次提取的上清液合并，混勻。

(2)凈化：將HLB小柱置于固相萃取裝置上，5 mL甲醇和5 mL水活化平衡SPE固相萃取柱，將提取液上樣，分別用5 mL水和5 mL 20%甲醇水溶液清洗，真空抽干，用5 mL甲醇-乙酸乙酯-氨水(體積比49∶49∶2)洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮氣吹干，20%甲醇水溶液定容至1 mL，渦旋30 s，過0.22 μm微孔濾膜，取10 μL進行UPLC分析。不稱取試樣，按上述步驟進行試劑空白試驗；使用陰性肉糜，按上述步驟進行空白試驗；在陰性肉糜中加入標準混合液，按上述步驟進行陽性添加試驗。

1.3.2 標準溶液的配制

單標儲備液的配制：分別稱取100.0 mg 9種磺胺和3種氟喹諾酮的標準品，甲醇稀釋，定容到100.00 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標準儲備液。

兩類獸藥混合標準液的配制：分別移取一定量的單標溶液并用甲醇定容，9種磺胺混合標準液質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL，3種氟喹諾酮混合標準液質(zhì)量濃度均為1.00 μg/mL。

混合工作液的配制：移取一定量的混和標準液，20%甲醇水溶液定容，磺胺質(zhì)量濃度梯度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL，氟喹諾酮質(zhì)量濃度梯度為0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.2 μg/mL。

1.3.3 UPLC法的建立

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速為0.2 mL/min，紫外檢測波長280 nm，熒光檢測激發(fā)波長λex=280 nm、發(fā)射波長λem=450 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，梯度洗脫，同時檢測兩類獸藥，梯度洗脫條件見表1。

1.3.4 檢出限、定量限及線性范圍的確定

參照1.3.3節(jié)將標準混合工作溶液上機測定，本試驗以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)計算定量限(LQD)。線性范圍最低點設(shè)定為出峰良好的最低濃度，最高點設(shè)定至超過國家限量濃度。磺胺線性范圍為0.01～1.0 μg/mL，氟喹諾酮線性范圍為0.001～0.200 μg/mL，共設(shè)定6個濃度點，以標準工作液質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標(X)，峰面積(μV×s)作為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算平方相關(guān)系數(shù)(square of correlation coefficient,R2)。

1.3.5 準確度和精密度試驗

將陰性生鮮豬肉制成肉糜，分別添加3個水平的磺胺類和氟喹諾酮類混合標準液，磺胺類添加量為20、40、100 μg/kg，氟喹諾酮類添加量為2、4、10 μg/kg，每個添加濃度平行測定6個樣品，計算回收率(recovery)，得到本方法的準確度，根據(jù)平行樣品的結(jié)果，計算相對標準偏差(relative standard deviations，RSD)，得到本方法的精密度。

1.3.6 方法的實際應(yīng)用

選用市售豬肉及其制品14份，其中生鮮肉7份，肉制品7份，其樣品前處理和檢測方法參照1.3.1和1.3.3，以此來評價該方法的實際應(yīng)用效果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Empower 3(美國Waters公司)軟件分析數(shù)據(jù)，使用Microcal Origin 7.5(Microcal Software公司)軟件制圖。陽性添加試驗均平行測定6次，計算RSD。樣品檢測平行測定2次，計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

磺胺類藥物在熒光檢測器上無響應(yīng)，在紫外檢測器響應(yīng)好；氟喹諾酮類在紫外和熒光檢測器上均有響應(yīng)，但熒光檢測器上比紫外檢測器靈敏度高。本試驗采用紫外串聯(lián)熒光檢測器的方法，所有目標物響應(yīng)高、峰型好、達到良好的分離度，可以降低方法檢出限。通過單標的保留時間對每個色譜峰定性，確定12種目標物的出峰時間及順序。9種磺胺及3種氟喹諾酮的標準品色譜圖如圖1和圖2所示。圖1中9種磺胺質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，圖2中3種氟喹諾酮質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，色譜峰上端標注標準色譜峰名稱和保留時間。

圖2 3種氟喹諾酮混合標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of 3 kinds of fluoroquinolones standards

2.2 標準曲線的線性，檢出限和定量限

本試驗采用外標法繪制標準曲線，12種標準物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。磺胺類獸藥在0.01～1.00 μg/mL，氟喹諾酮類獸藥在0.001～0.200 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均可達到0.999以上?；前奉悪z出限為1.2～3.5 μg/kg，定量限為4.0～11.7 μg/kg，氟喹諾酮類檢出限為0.12～0.5 μg/kg，定量限為0.4～1.7 μg/kg。

表2 9種磺胺及3種氟喹諾酮線性范圍、線性方程、平方相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear range, linear equation, square of correlation coefficient, LOD and LOQ of 9 sulfonamides and 3fluoroquinolones

2.3 準確度與精密度

將不同質(zhì)量濃度的標準液添加至陰性豬肉糜中，制備不同添加濃度的樣品，采用UPLC法檢測樣品中獸藥殘留的回收率及相對標準偏差(RSD)，每個濃度平行測定6樣。結(jié)果(表3)顯示：3個不同濃度水平加標回收率在70.0%～98.0%，RSD為1.09%～4.64%，RSD小于5%，這表明該方法準確度高、精密度好，可以滿足肉及肉制品中的磺胺類和氟喹諾酮類獸殘檢測。

2.4 方法的實際應(yīng)用

為證實本方法的實際應(yīng)用價值，選取16份市售豬肉及其制品為研究對象，其中1號樣品(陰性對照)和2號樣品(陽性添加)作為本試驗的質(zhì)量控制樣品。試驗結(jié)果(表4)表明：在14份樣品中，3種氟喹諾酮均未檢出，但有樣品檢出磺胺類藥物殘留，例如：3號豬肉樣品中檢出SIZ 17.5 μg/kg；4號豬肉樣品中檢出SMM 11.0 μg/kg；6號豬肉樣品中檢出SIZ 33.0 μg/kg、SDM 31.0 μg/kg；9號豬肉樣品中檢出SDM 13.5 μg/kg；在10號香腸樣品中檢出SM250.0 μg/kg、SMM 19.0 μg/kg、SIZ 24.0 μg/kg，11號火腿腸中檢出SM277.5 μg/kg，12號鹵肉樣品中檢出SM259.0 μg/kg、SMM 38.0 μg/kg，13號鹵肉樣品中檢出SM231.0 μg/kg、SMZ 49.5 μg/kg、SDM 11.5 μg/kg，15號鹵肉樣品中檢出SMM 19.0 μg/kg、SQ 14.0 μg/kg。

3 結(jié)論

表3 加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recovery and relative standard deviation(n=6)

表4 市售肉及肉制品磺胺類和氟喹諾酮類獸殘檢測結(jié)果Table 4 Detection results of sulfonamides and fluoroquinolones in meat and meat products

注：“-”為未檢出，“+”為檢出 。

超高效液相色譜法具有峰形良好、溶劑使用量小、分析時間短、檢出限低等優(yōu)點，文獻表明UPLC法測定畜禽肉中的磺胺類獸藥殘留，檢出限可以達到2～6 μg/kg[21]。本試驗采用UPLC紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器同時檢測豬肉中的9種磺胺類和3種氟喹諾酮類藥物，所有檢測目標物分離良好，磺胺類檢出限為1.2～3.5 μg/kg，氟喹諾酮類檢出限為0.12～0.50 μg/kg，該檢出限低于現(xiàn)行有效檢測方法GB 29694—2013以及農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008中磺胺類5 μg/kg[14]和氟喹諾酮類20 μg/kg[15]。低、中、高3個濃度水平加標回收率在70.0%～98.0%，RSD均小于5%，表明該方法具有高準確度和高精密度。該方法應(yīng)用于豬肉及其制品的檢測，達到了良好的檢測結(jié)果，可應(yīng)用于畜肉及其制品的磺胺類及氟喹諾酮類獸藥殘留的高通量快速檢測。