秦奔，張海鵬，鄭飛云，鈕成拓，劉春鳳，王金晶，李永仙，李崎

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

麥芽是啤酒生產(chǎn)的主要原料之一，不同種類(lèi)的麥芽生產(chǎn)出的啤酒在風(fēng)味、口感以及顏色上都會(huì)有所差異[1]。巧克力麥芽因其特殊的風(fēng)味和顏色，對(duì)啤酒品種的增加和豐富具有很好的作用[2]。麥芽的風(fēng)味形成是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，通過(guò)美拉德反應(yīng)以及焦糖化等作用，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[3-5]，成品麥芽呈巧克力褐色，業(yè)界將具有700～1 300 EBC色度且具有類(lèi)似巧克力風(fēng)味的麥芽統(tǒng)稱為巧克力麥芽[6]。可可是制作巧克力的原料，由于巧克力是經(jīng)過(guò)加工后的產(chǎn)品，風(fēng)味差異較大，所以一般以可可風(fēng)味來(lái)代表巧克力風(fēng)味。在啤酒釀造過(guò)程中，添加少量的巧克力麥芽就能給成品啤酒帶來(lái)獨(dú)特的色澤，并且具有堅(jiān)果、咖啡或巧克力可可的風(fēng)味特征[7-9]，除此之外，巧克力麥芽還被應(yīng)用于其他食品的生產(chǎn)[10]。

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer,GC-MS)技術(shù)能夠?qū)]發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)與定量[11-12]，但該技術(shù)無(wú)法感知?dú)馕杜c風(fēng)味強(qiáng)度。本文選用氣相色譜質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer, GC-O-MS)技術(shù)，在GC-MS的基礎(chǔ)上，連接一個(gè)嗅聞裝置，以人的嗅覺(jué)為檢測(cè)器，對(duì)風(fēng)味進(jìn)行描述，并且感知風(fēng)味強(qiáng)度。由于GC-O-MS具有的感知?dú)馕?，以及時(shí)間-強(qiáng)度法實(shí)驗(yàn)操作次數(shù)少，能夠快速推斷樣品中的主要特征風(fēng)味物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，使得GC-O-MS技術(shù)在香精、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13]。本研究選用頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro-extraction,HS-SPME)技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用(GC-O-MS)分析并鑒定巧克力麥芽中的可可特征風(fēng)味物質(zhì)，能夠?yàn)榍煽肆溠康亩x、深入研究以及指導(dǎo)生產(chǎn)提供理論性參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

麥芽：淺色麥芽(加拿大麥芽)，購(gòu)自中糧麥芽(江陰)有限公司；巧克力麥芽1號(hào)(美國(guó))，購(gòu)自上海金啤食品原料有限公司；巧克力麥芽2號(hào)(樂(lè)斐)、焦香麥芽、黑麥芽，購(gòu)自新西蘭Gladfield公司；巧克力麥芽3號(hào)(維耶曼)、巧克力麥芽4號(hào)(比利時(shí))、巧克力麥芽5號(hào)(比利時(shí)城堡)、巧克力麥芽6號(hào)(歐麥)，市售麥芽。

標(biāo)樣：2,6-二甲基吡嗪(99%，Adamas)，三甲基吡嗪(99%，Adamas)，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(95%，Aldrich)，2-甲氧基-3-甲基吡嗪(99%，Aladdin)。

1.2 儀器與設(shè)備

DLEUW22050麥芽粉碎機(jī)，Buhler-Miag公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010)，日本島津(Shimadzu)公司；嗅覺(jué)檢測(cè)器，德國(guó)Gerstal公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣器、萃取纖維頭2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS、20 mL具塞頂空瓶，美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：45 ℃保持1 min，以6 ℃/min速度上升到230 ℃，保持6 min；載氣為He氣，流速1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸時(shí)間1 min；不分流。

1.3.1.2 質(zhì)譜條件

離子源EI源；離子源溫度：200 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV，掃描質(zhì)量范圍33～400 u；進(jìn)樣條件：手動(dòng)進(jìn)樣。

1.3.2 樣品預(yù)處理以及SPME提取方法

取低溫下保存的麥芽樣品10 g，用粉碎機(jī)粉碎，精確稱取3.00 g麥芽細(xì)粉倒入20 mL具塞頂空瓶中，加蓋密封，在60 ℃水浴中平衡10 min，然后用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在具塞頂空瓶中上部吸附萃取50 min，在氣相色譜進(jìn)樣口250 ℃進(jìn)行解吸，解吸時(shí)間1 min。

1.3.3 GC-O分析方法

在毛細(xì)管柱出口處連接嗅聞裝置，質(zhì)譜和嗅聞裝置分流比為1∶1。實(shí)驗(yàn)之前，選定實(shí)驗(yàn)室感官評(píng)定小組中3個(gè)經(jīng)過(guò)風(fēng)味訓(xùn)練、并有一定經(jīng)驗(yàn)的研究人員作為感官品評(píng)員進(jìn)行GC-O嗅聞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在同一嗅聞風(fēng)味出峰點(diǎn)，至少需要有兩位感官評(píng)定員嗅聞得到相同的感官描述，才能記入最終的結(jié)果。感官評(píng)定員不僅要對(duì)物質(zhì)的香氣進(jìn)行描述，還要確定風(fēng)味化合物的香氣強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)選擇5分制來(lái)進(jìn)行香氣強(qiáng)度的評(píng)價(jià)，即“0”表示沒(méi)有香氣，“1”表示香氣微弱，“2”表示香氣較弱，“3”表示香氣中等，“4”表示香氣較強(qiáng)，“5”表示香氣很強(qiáng)，有刺激性味道。

1.3.4 化合物定性方法

風(fēng)味物質(zhì)經(jīng)過(guò)質(zhì)譜儀分析得到的數(shù)據(jù)通過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，選擇匹配度最高的鑒定結(jié)果，并在相同色譜條件下，通過(guò)對(duì)C6～C30正構(gòu)烷烴的色譜掃描，計(jì)算得到各化合物的保留指數(shù)(retention index，RI)值，與相應(yīng)的文獻(xiàn)值[14]進(jìn)行對(duì)照，同時(shí)，經(jīng)過(guò)感官評(píng)定員嗅聞描述的化合物香味特征與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證定性結(jié)果。

1.3.5 OAV值的計(jì)算方法

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將3種吡嗪類(lèi)化合物標(biāo)樣配置成混標(biāo)，并稀釋成10、50、100、500、1 000 μg/L的質(zhì)量濃度梯度，以50 μg/L的2-甲氧基-3-甲基吡嗪作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行校正，取5 mL混標(biāo)以及50 μL的內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，并以各標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，吡嗪類(lèi)化合物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，分別做標(biāo)曲。

1.3.5.2 三種吡嗪類(lèi)物質(zhì)的定量檢測(cè)

取低溫下保存的麥芽樣品10 g，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，精確稱取5.00 g的麥芽細(xì)粉，溶于100 mL水中，45 ℃下浸提30 min，升溫至70 ℃浸提60 min，取5 mL浸提液以及50 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，采用內(nèi)外標(biāo)法進(jìn)行GC-MS定量檢測(cè)。

1.3.5.3 OAV的計(jì)算方法

根據(jù)內(nèi)外標(biāo)法對(duì)麥芽中的香氣成分的定量檢測(cè)結(jié)果以及各物質(zhì)的香氣閾值，按式(1)計(jì)算OAV值。

(1)

式中：C,根據(jù)內(nèi)外標(biāo)法得出的該化合物的質(zhì)量濃度,μg/kg；OT,該化合物的嗅覺(jué)閾值,μg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 巧克力麥芽1號(hào)樣品GC-O-MS分析

通過(guò)GC-O-MS技術(shù)對(duì)市售麥芽樣品巧克力麥芽1號(hào)的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)與分析，共檢測(cè)得到47種揮發(fā)性化合物，包括14種醛類(lèi)、7種醇類(lèi)、5種酮類(lèi)、5種酸類(lèi)、6種吡嗪類(lèi)以及其他一些特殊的風(fēng)味物質(zhì)。其總離子流圖譜見(jiàn)圖1，并對(duì)各種風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行香氣描述，記錄其風(fēng)味強(qiáng)度，其檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

圖1 巧克力麥芽1號(hào)總離子流圖Fig.1 The total ion flow diagram of chocolate malt 1

由于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間存在疊加、協(xié)同的作用，多種風(fēng)味化合物共同構(gòu)成了麥芽的風(fēng)味。根據(jù)不同風(fēng)味物質(zhì)的香氣強(qiáng)度，能夠判斷出單一風(fēng)味物質(zhì)對(duì)麥芽整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)度，同時(shí)，根據(jù)對(duì)風(fēng)味化合物的感官描述，能夠找出具有不同風(fēng)味特征的物質(zhì)[15]。表1顯示了巧克力麥芽1號(hào)所檢測(cè)出的47種風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間、化合物名稱、匹配度、風(fēng)味描述、風(fēng)味強(qiáng)度、峰面積以及峰面積百分比。其中11種風(fēng)味化合物的氣味明顯(風(fēng)味強(qiáng)度>3)，對(duì)巧克力麥芽風(fēng)味組成貢獻(xiàn)較大，分別是3-甲基丁醛(麥芽香)、庚醛(奶油脂香)、2,6-二甲基吡嗪(可可香)、三甲基吡嗪(可可香)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(可可香)、醋酸(酸味)、糠醛(杏仁、焦糖香)、菠蘿酮(焦糖香)、順式-5-甲基-2-異丙基-己烯醛(堅(jiān)果、花生)、2-乙酰吡咯(烤面包)、麥芽酚(焦糖香)，其中具有可可特征風(fēng)味(可可香)的化合物有三種，它們對(duì)巧克力麥芽中的可可風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，分別為2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。

表1 GC-O-MS測(cè)定巧克力麥芽1號(hào)中揮發(fā)性風(fēng)味化合物Table 1 Determination of volatile flavor compounds in chocolate malt I by GC-O-MS

注：嗅聞強(qiáng)度中， “1”表示香氣微弱，“2”表示香氣較弱，“3”表示香氣中等，“4”表示香氣較強(qiáng)，“5”表示香氣很強(qiáng)，有刺激性味道。

2.2 可可特征風(fēng)味物質(zhì)的鑒定

2.2.1 三種吡嗪類(lèi)物質(zhì)的性質(zhì)

3種吡嗪類(lèi)物質(zhì)同屬于烷基吡嗪類(lèi)，2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪天然存在于肉、可可、咖啡等食品中，而2-乙基-3,5-二甲基吡嗪天然存在于炒花生、咖啡、炒大麥及爆米花等中，食品中這3種吡嗪類(lèi)物質(zhì)都是在焙烤、炒制過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)等作用產(chǎn)生的，并且這3種吡嗪類(lèi)物質(zhì)都是國(guó)標(biāo)中允許使用的食品香精，主要用于配制巧克力、咖啡、烤堅(jiān)果等香精[16]。

2.2.2 與可可粉的比較與分析

由文獻(xiàn)可知，可可粉中具有的可可特征風(fēng)味物質(zhì)有3種，分別是2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪以及2,3,5,6-四甲基吡嗪[17]，在可可加工和巧克力制品中都是重要的特征性風(fēng)味物質(zhì)。其中，2,5-二甲基吡嗪與2,6-二甲基吡嗪互為同分異構(gòu)體，出峰時(shí)間相近，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中可能出現(xiàn)風(fēng)味掩蓋的現(xiàn)象。而2,3,5,6-四甲基吡嗪在本實(shí)驗(yàn)中未能檢測(cè)到。由于巧克力麥芽與可可粉的原料以及生產(chǎn)工藝存在差異，而巧克力麥芽只是具有類(lèi)似可可、巧克力的風(fēng)味，所以巧克力麥芽的可可特征風(fēng)味物質(zhì)并不一定與可可粉完全相同。

2.2.3 不同麥芽樣品吡嗪類(lèi)物質(zhì)的比較與分析

由文獻(xiàn)可知，特種麥芽中所具有的可可、咖啡、堅(jiān)果以及烘烤味等風(fēng)味一般是由烷基吡嗪類(lèi)化合物產(chǎn)生的[18-19]，與本文GC-O結(jié)果相符。在焙烤過(guò)程中，吡嗪類(lèi)物質(zhì)通過(guò)美拉德反應(yīng)等作用產(chǎn)生[20]，其含量隨著焙烤程度的加深先增加后減少，呈鐘形變化[21]。為了驗(yàn)證在不同的巧克力麥芽樣品中是否都具有2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪這三種吡嗪類(lèi)物質(zhì)，選擇國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上常見(jiàn)的6種品質(zhì)優(yōu)良的巧克力麥芽樣品以及淺色麥芽、焦香麥芽和黑麥芽樣品，對(duì)吡嗪類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)進(jìn)行了比較與分析，其結(jié)果如表2所示，“ND”表示未檢測(cè)出。

表2 不同麥芽樣品中吡嗪類(lèi)物質(zhì)分析Table 2 Analysis of pyrazines in different malt samples

由表2可知，巧克力麥芽1號(hào)樣品中的12種吡嗪類(lèi)物質(zhì)，幾乎都可以在其他5種巧克力麥芽樣品中檢測(cè)到，而在淺色麥芽中幾乎檢測(cè)不到吡嗪類(lèi)物質(zhì)，在焦香麥芽以及黑麥芽中吡嗪類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)較少、含量較低，說(shuō)明巧克力麥芽與其他種類(lèi)麥芽的吡嗪類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量都有明顯的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巧克力麥芽的焙烤程度處于烷基吡嗪類(lèi)物質(zhì)生成量較高的時(shí)期，由于這3種吡嗪類(lèi)物質(zhì)都是在焙烤過(guò)程中產(chǎn)生的，并且產(chǎn)品原料都來(lái)自于大麥，可以確定在巧克力麥芽中都具有這三種吡嗪類(lèi)物質(zhì)，其主要差異在于物質(zhì)的含量。

2.2.4 麥芽樣品中吡嗪類(lèi)物質(zhì)的香氣閾值及香氣活度值(OAV)

巧克力麥芽中吡嗪類(lèi)物質(zhì)雖然含量較低，但是由于其風(fēng)味閾值極低，所以吡嗪類(lèi)物質(zhì)對(duì)麥芽風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大。對(duì)麥芽樣品中3種吡嗪類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了定量檢測(cè)與分析，其線性關(guān)系、香味閾值以及OAV值如表3所示。

表3 麥芽樣品中三種吡嗪類(lèi)物質(zhì)的線性關(guān)系、香氣閾值以及OAV值Table 3 The odor threshold, linearity and OAV of three pyrazines in the sample of Malt

注：a各物質(zhì)在葵花油中測(cè)定的香氣閾值；b各物質(zhì)的OAV值均保留兩位小數(shù)；c嗅覺(jué)閾值數(shù)據(jù)來(lái)源于文獻(xiàn)[22]；d嗅覺(jué)閾值數(shù)據(jù)來(lái)源于文獻(xiàn)[23]。

由于麥芽基體中的吡嗪類(lèi)物質(zhì)的香氣閾值并未報(bào)道，所以本文統(tǒng)一選用葵花油中測(cè)定的香味閾值[22-23]。將5.00 g粉碎后的麥芽經(jīng)浸提后，再通過(guò)GC-MS技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，計(jì)算得到OAV值。表3結(jié)果表明，巧克力麥芽中，2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪這3種吡嗪類(lèi)物質(zhì)的OAV值都大于1，對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié)論

本論文采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-O-MS技術(shù)，分析并鑒定了巧克力麥芽樣品中的可可特征風(fēng)味物質(zhì)，并通過(guò)OAV值以及與其他樣品麥芽的比較進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在這類(lèi)巧克力麥芽中，具有巧克力可可特征風(fēng)味的化合物有3種，對(duì)巧克力麥芽的可可風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，分別為2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。本研究所得到的結(jié)論也將為巧克力麥芽的定義、研究以及生產(chǎn)提供理論性參考依據(jù)。由于巧克力麥芽原料、制麥及焙烤生產(chǎn)過(guò)程中的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致巧克力麥芽的生產(chǎn)質(zhì)量與風(fēng)味品質(zhì)無(wú)法得到保證，因此巧克力麥芽制作過(guò)程中的物質(zhì)變化、條件控制以及風(fēng)味穩(wěn)定性將作為以后研究的重點(diǎn)問(wèn)題。