許雪兒，李娟，陳正行*，王濤，王韌，王莉，羅小虎

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2 (江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

我國(guó)玉米年產(chǎn)量高達(dá)2.153億t，其中近兩成用于制備玉米淀粉，在淀粉提取過(guò)程中所得分離產(chǎn)物玉米蛋白因其蛋白質(zhì)組成不符合人體必需氨基酸組成需求而不被利用，其中玉米醇溶蛋白(zein)占據(jù)60%[1]。zein作為生物大分子其疏水氨基酸含量較高，溶于35%～90%乙醇而不溶于水和無(wú)水乙醇，利用zein特有的兩親性和獨(dú)特溶解性，能夠有效制備納米顆粒，但因穩(wěn)定性較差，影響了應(yīng)用[2]。阿拉伯膠(arabic gum，AG)是一種天然陰離子多糖，其結(jié)構(gòu)上帶有部分蛋白物質(zhì)及鼠李糖，若能通過(guò)靜電相互作用與zein有效結(jié)合，則可提高zein在水中的溶解性，并提高對(duì)酸堿鹽的耐受性[3]。生育酚(tocopherol，TOC)作為抗氧化性很強(qiáng)的功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)因其不穩(wěn)定性限制了在人體內(nèi)的有效輸送，通過(guò)制備所得zein-AG納米顆粒對(duì)TOC進(jìn)行高效負(fù)載，達(dá)到緩釋效果[4]。制備zein納米顆粒時(shí)在親水膠體的選擇上前人多選擇果膠等進(jìn)行研究，王麗娟等[5]研究果膠復(fù)合zein并負(fù)載姜黃素，結(jié)果表明果膠的加入有利于提高納米顆粒的穩(wěn)定性和姜黃素的抗氧化性，但對(duì)于AG的研究甚少，且未見(jiàn)有關(guān)于不同zein初始儲(chǔ)備液濃度、不同醇水比對(duì)形成納米顆粒的影響的研究報(bào)道，而在實(shí)際制備中，以上都是極為重要的影響因素。石燕等[6]研究AG復(fù)合乳清蛋白制備微膠囊壁材，制得的壁材在穩(wěn)定性和韌性等方面均高于單純的乳清蛋白壁材。

本文通過(guò)反溶劑法結(jié)合AG制備負(fù)載TOC的zein納米顆粒，研究zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度、體系中乙醇與水體積比(醇水比)、pH值、鹽離子濃度對(duì)納米顆粒穩(wěn)定性影響，并對(duì)負(fù)載TOC的比例和包封率進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，河南華瑞生物科技有限公司；阿拉伯膠、α-生育酚，美國(guó)Sigma試劑公司；AR級(jí)NaOH、HCl、無(wú)水乙醇、石油醚,上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，德國(guó)IKA儀器有限公司；Himac CR21G型冷凍干燥機(jī)，日本 HITACHI 公司； Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀，英國(guó)Marlven儀器公司；WFZ UV-2000型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司；LXJ-IIB型低速臺(tái)式離心機(jī)，中國(guó)上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9101·3SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，中國(guó)上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 納米顆粒制備

稱取0.5 g zein溶解于10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇中，磁力攪拌30 min作為zein儲(chǔ)備液；稱取2 g AG溶解于10 mL去離子水中，磁力攪拌1 h得到AG儲(chǔ)備液；量取800 μL zein儲(chǔ)備液呈細(xì)流狀移至38.9 mL的去離子水中，隨后移取300 μL AG儲(chǔ)備液至去離子水中(zein與AG質(zhì)量比為1∶1.5，前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)比例)，磁力攪拌60 min后4 000 /min離心10 min后取上清液得zein-AG納米顆粒[7]。

1.3.2 不同zein儲(chǔ)備液濃度下納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)測(cè)定

分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 、0.6、0.7 g zein溶解于10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇中，磁力攪拌30 min作為質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、70 g/L(質(zhì)量濃度)的zein儲(chǔ)備液，隨后按照zein與AG質(zhì)量比為1∶1.5加入zein、AG并調(diào)節(jié)納米顆粒pH=4，其他步驟同1.3.1；所得納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.3.3 不同醇水比下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定

取不同體積zein的乙醇儲(chǔ)備液與樣品中水體積比為1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶5，調(diào)節(jié)并固定納米顆粒pH=4，其他步驟同1.3.1(zein與AG質(zhì)量比為1∶1.5)。

1.3.4 不同pH值下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定

用pH=3～9的磷酸鹽緩沖液分別對(duì)樣品進(jìn)行pH調(diào)控。取1 mL新鮮制備的不同pH值的zein-AG納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 不同鹽離子摩爾濃度下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定

移取10 mL新鮮制備的納米顆粒，加入10 mL不同鹽離子摩爾濃度(0～100 mmol/L)溶液攪拌均勻后靜置30 min。取1 mL新鮮制備的含不同鹽離子摩爾濃度的zein-AG納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 掃描電鏡

將最優(yōu)條件下所制得納米顆粒經(jīng)旋蒸除去乙醇后放入冷凍干燥機(jī)中凍干得固體樣品，取少許樣品放置于導(dǎo)電膠上固定后噴金，采用電子束對(duì)樣品進(jìn)行微觀形貌拍攝，探針電壓為30 kV, 電流為50 pA，電子束加速電壓為5 kV, 放大倍數(shù)為20 000倍[9]。

1.3.7 負(fù)載TOC的納米顆粒制備

稱取0.5 g zein溶解于10 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇中，磁力攪拌30 min作為zein儲(chǔ)備液，稱取2 g AG溶解于10 mL去離子水中，磁力攪拌1 h得到AG儲(chǔ)備液；量取800 μL zein儲(chǔ)備液，并加入相應(yīng)體積TOC，磁力攪拌30 min以充分溶解(按照zein-AG與TOC質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)得負(fù)載TOC的zein儲(chǔ)備液；取800 μL TOC-zein儲(chǔ)備液呈細(xì)流狀移至38.9 mL的去離子水中，隨后移取300 μL AG儲(chǔ)備液至去離子水中(zein與AG質(zhì)量比為1∶1.5，前期實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)比例)，磁力攪拌60 min后4 000 /min離心10 min 后取上清液得TOC-zein-AG納米顆粒。

1.3.8 不同zein-AG與TOC質(zhì)量比納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(shù)(PDI)測(cè)定

制備不同zein-AG與TOC質(zhì)量比(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)的納米顆粒，取1 mL新鮮制備的不同TOC含量的zein-AG納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 TOC包封率測(cè)定

zein-AG納米顆粒對(duì)生育酚包封率測(cè)定：移取5 mL負(fù)載生育酚的納米顆粒、3 mL石油醚置于燒杯中，置于磁力攪拌器上攪拌60 min萃取得游離的生育酚，用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，用石油醚稀釋至10倍，以石油醚作為空白對(duì)照，在 298 nm下測(cè)定樣品的吸光值，根據(jù)TOC在石油醚中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.007 8+0.009，R2=0.995，算出游離生育酚含量后，按照式(1)計(jì)算包封率[10]：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

如圖1-a所示，隨著zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度的升高，10～5 g/L內(nèi)粒徑無(wú)顯著性變化，維持在125 nm，PDI均在0.3以下；高于50 g/L時(shí)，粒徑顯著上升，達(dá)到200 nm左右，PDI也上升至大于0.3；如圖1-b所示，隨著zein初始儲(chǔ)備液濃度的升高，電位變化與粒徑均向不穩(wěn)定趨勢(shì)變化，即10～50 g/L內(nèi)電位在-32 mV左右無(wú)顯著性變化，zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度高于50 g/L時(shí)，電位顯著增大，但仍小于-25 mV；zein儲(chǔ)備液濃度較低時(shí)，zein分子充分分散到水相中，體系較為穩(wěn)定；當(dāng)zein在80%乙醇中濃度過(guò)高時(shí)，溶解的zein達(dá)到飽和狀態(tài)，部分過(guò)剩的zein分子影響其反溶劑制備過(guò)程中納米顆粒的粒徑和PDI值。該結(jié)果與王麗娟[11]、FU等[12]研究果膠復(fù)配zein納米顆粒時(shí)提出的zein初始儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度過(guò)高影響納米顆粒粒徑的假設(shè)結(jié)果一致。由圖1可知，制備zein-AG納米顆粒時(shí)，應(yīng)選取5 g/L的zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度，既能夠有效提高制備效率，又不對(duì)粒徑、電位等指標(biāo)產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖1 不同質(zhì)量濃度zein儲(chǔ)備液下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位對(duì)比圖Fig.1 The effect of the different concentrations of zein in the particle size, PDI, zeta- potential of the zein-AG nanoparticles

2.2 不同醇水比下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

如圖2-a所示，隨著醇水比的增大，粒徑無(wú)顯著性變化，控制在125 nm，PDI控制在0.2～0.35間，呈現(xiàn)降低趨勢(shì)但無(wú)顯著變化；如圖2-b所示，隨著醇水比的提高，電位也無(wú)顯著性變化，總體趨勢(shì)為電位降低，控制在-32 mV左右。綜合圖2可知，體系中乙醇與水的比例對(duì)體系的影響不顯著，可能是因?yàn)閦ein分子完全溶解于80%乙醇中，經(jīng)過(guò)液-液自組裝后由于zein獨(dú)特的自組裝性和AG的有效結(jié)合[13]，使得納米顆粒均穩(wěn)定分散在水體系中。該結(jié)果與YING提出zein制備得納米顆粒對(duì)于乙醇的依賴性較低，且親水膠體的結(jié)合有利于顆粒在水中的穩(wěn)定性的結(jié)果一致[14]，因此從工業(yè)制備節(jié)約成本方面考慮，體系中應(yīng)盡可能減少高成本乙醇的加入，選擇醇水比為1∶50進(jìn)行制備使納米顆粒能夠穩(wěn)定存在。

圖2 不同醇水比下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位對(duì)比圖Fig.2 The effect of the different ratio of the ethanol∶water in the particle size, PDI, zeta-potential of the zein-AG nanoparticles

2.3 不同pH值下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

不同pH下納米顆粒粒徑、PDI如圖3-a所示，粒徑在120～140 nm無(wú)顯著變化；PDI在pH=3時(shí)稍大于0.3，pH=4～9時(shí)均小于0.3呈穩(wěn)定態(tài)，不同pH下納米顆粒電位如圖3-b所示，在pH=3時(shí)，電位相對(duì)較低為-17.8 mV，可能是因?yàn)閜H=3時(shí)AG的荷電量較低，從而zein-AG納米顆粒表面凈電荷較少，因此體系電位不太穩(wěn)定[15]；在pH=4～9內(nèi)，電位都較為穩(wěn)定且為-30～-40 mV。zein-AG納米顆粒在pH=3～9條件下均能較好保持納米顆粒狀態(tài)并維持穩(wěn)定，相比單純zein納米顆粒在等電點(diǎn)附近嚴(yán)重聚集的現(xiàn)象有顯著改善。該結(jié)果與黃曉霞等研究果膠復(fù)合zein在pH=3較接近果膠的等電點(diǎn)時(shí)電位略低，pH=4～9時(shí)穩(wěn)定性非常好的結(jié)果一致[16]。

圖3 不同pH下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位圖粒徑、PDI；電位Fig.3 The effect of pH in the particle size, PDI, zeta-potential of the zein-AG nanoparticles

2.4 不同鹽離子濃度下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

不同鹽離子濃度下納米顆粒粒徑、PDI、電位如表1所示。鹽離子濃度在0～20 mmol/L內(nèi)，粒徑、PDI隨著鹽離子濃度升高而顯著增大至290.3 nm，電位逐漸增大至-20.2 mV，體系變得不穩(wěn)定；鹽離子濃度大于20 mmol/L時(shí)粒徑為微米級(jí)，納米顆粒嚴(yán)重絮凝，PDI為1；電位為-5 mV左右，即對(duì)鹽離子耐受程度較弱，表明AG與zein通過(guò)靜電相互作用結(jié)合而成[17]，作用力能夠抵抗20 mmol/L的鹽離子濃度。LUO等研究低離子強(qiáng)度下納米顆粒就會(huì)發(fā)生絮凝的結(jié)果與該結(jié)果相同[18]。

表1 不同鹽離子濃度下納米顆粒粒徑、PDI、電位表Table 1 The effect of PH in the the different concentrations of salt in the particlesize, PDI, zeta-potential of thenanoparticles

注：表中相同字母代表差異不顯著(p<0.05);不同字母代表差異顯著(p<0.05)。下同。

2.5 zein-AG納米顆粒掃描電鏡結(jié)果

圖5所示是zein納米顆粒和zein-AG納米顆粒的掃描電鏡的微觀圖，其中zein-AG納米顆粒為最優(yōu)條件(5%的zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度、醇水比為1∶50)下制備所得。

a-zein 納米顆粒；b-zein-AG納米顆粒圖5 納米顆粒掃描電鏡圖(×20 000)Fig.5 The SEM of the nanoparticles

圖5-a顯示，未復(fù)合AG的zein納米顆粒大小不均一，且有明顯粘連，因?yàn)閦ein納米顆粒的復(fù)溶性較差導(dǎo)致其顆粒間存在聚集狀態(tài)；該結(jié)果與黃旭琳等[19]研究結(jié)果相同；圖5-b顯示zein-AG納米顆粒呈現(xiàn)圓形，大小均一，且AG、zein沒(méi)有分離狀態(tài)，而是較好的復(fù)合在一起，該微觀圖與[11]等研究果膠復(fù)合zein納米顆粒掃描電鏡圖反映出的結(jié)果相同，即AG能夠通過(guò)靜電相互作用結(jié)合zein形成穩(wěn)定的納米顆粒。

2.6 不同zein/AG與TOC質(zhì)量比納米顆粒負(fù)載生育酚粒徑、PDI、電位值

不同zein/AG∶TOC比例納米顆粒粒徑、PDI如圖6-a所示，隨著納米顆粒負(fù)載生育酚濃度的變大，粒徑逐漸增高，小于1∶5時(shí)，負(fù)載生育酚的納米顆粒粒徑、PDI均較為穩(wěn)定，此時(shí)TOC能夠完全結(jié)合納米顆粒；zein/AG與TOC質(zhì)量比為1∶5時(shí)粒徑為180.3 nm，PDI為0.29；大于1∶5時(shí)納米顆粒粒徑較大達(dá)到200 nm；PDI也大于0.3；圖6-b所示隨著zein/AG與TOC質(zhì)量比減小，納米顆粒電位也逐漸下降，大于1∶1.5時(shí)電位雖下降但無(wú)顯著性，在-30 mV左右。該結(jié)果與WONGSASULAK等研究結(jié)果一致[20]。綜上所述，zein/AG與TOC質(zhì)量比1∶5時(shí)粒徑、PDI、電位和包封率既穩(wěn)定又高效，達(dá)到zein大分子高效負(fù)載生育酚的目的。

圖6 不同zein/AG與TOC質(zhì)量比納米顆粒粒徑、PDI、電位對(duì)比圖Fig.6 The effect of zein/AG∶TOC in the particlesize, PDI, zeta- potential of the nanoparticles

2.5 zein-AG納米顆粒負(fù)載生育酚包封率

由表2可知，隨著zein-AG納米顆粒負(fù)載生育酚含量的增大，體系包封率逐漸下降，在zein/AG與TOC質(zhì)量比小于1∶5時(shí)，包封率逐漸增大至94.1%但無(wú)顯著性，此時(shí)納米顆粒體系中TOC的比例較小，能夠完全被zein-AG結(jié)合，因而負(fù)載能力較強(qiáng)；在zein/AG與TOC質(zhì)量比大于1∶5時(shí)，包封率顯著降低，TOC比例過(guò)高導(dǎo)致負(fù)載能力較弱。zein/AG與TOC質(zhì)量比為1∶5時(shí)，包封率仍達(dá)到86.9%。管驍?shù)妊芯葵湸既艿鞍棕?fù)載白藜蘆醇時(shí)，負(fù)載率為90.4%能夠支撐上述結(jié)果[21]；SUN等研究納米顆粒負(fù)載姜黃素時(shí)，姜黃素含量越高包封率越低的結(jié)果一致[22]。

表2 不同zein/AG與TOC質(zhì)量比下納米顆粒對(duì)生育酚的包封率Table 2 The effect of zein/AG∶TOC of the encapsulationefficiency of TOC

3 結(jié)論

通過(guò)前期優(yōu)化醇水比、zein儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度等參數(shù)制備得到的復(fù)合AG的zein納米顆粒能夠耐酸堿，并一定程度上耐受鹽離子，對(duì)于TOC的包封率較高達(dá)到90%左右，由此表明，AG可作為保護(hù)zein更好體內(nèi)緩釋輸送藥物的一種親水性生物大分子進(jìn)行使用， zein-AG復(fù)合納米顆粒也可作為T(mén)OC的有效載體應(yīng)用于其活性的保護(hù)與長(zhǎng)效利用。