李長樂，王琛，郭全友，王錫昌,3,4，楊文莉，包海蓉,3,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(東海水產研究所，上海，200090) 3(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 4(農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

超聲波技術已廣泛應用于醫(yī)藥制備、化工和化妝品等行業(yè)，超聲波可以產生4種效應，即機械、空化、熱和化學效應，它們共同作用于底物，加快了底物的物化反應[1-2]。近年來，由于超聲波技術對食品中生物大分子的改性具有較好的效果，已被廣泛地用于食品乳化、嫩化和功能的改性[3]，且具有效率高、成本低、操作簡單、污染小等優(yōu)點。

超高壓技術做為一種新型食品加工方法，已在肉制品和水產品等領域中廣泛應用。經超高壓處理的食品不僅達到殺菌的目的，并且可較好地保持食品原有的營養(yǎng)物質和感官品質[4-5]，是食品工業(yè)中最有潛力和發(fā)展前途的重點開發(fā)技術之一[6-7]。超高壓技術具有冷殺菌作用、改善食品結構特性和品質風味、保持原有營養(yǎng)成分、延長食品貨架期等作用[8]。另外，超高壓處理還具有操作方便安全、加壓迅速、受壓均一、能耗較小等優(yōu)點[9]。

近年來由于捕獲金槍魚的漁船數量增加，鰹魚的產量也隨之增加，我國對鰹魚的消費主要以罐頭為主。但罐頭產品較明顯的弊端是產品品質低[10-11]，主要表現在成品魚肉的質構軟爛、膠原蛋白降解程度高、營養(yǎng)成分損失嚴重，這些都限制了市場對鰹魚產品的消費，進而阻礙了鰹魚加工產業(yè)的發(fā)展。但鰹魚肉富含蛋白質(26.14%)[12]。對鰹魚肌原纖維蛋白進行改性，提高其功能性質，有利于解決目前鰹魚利用率低、市場潛力小的問題。因此，本實驗以鰹魚為原料，探究超聲波、超高壓處理對鰹魚肌原纖維蛋白(MP)功能性質的影響，旨在為超聲波、超高壓技術在肌肉蛋白質制品中的應用提供技術參數和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰹魚(Katsuwonuspelamis)，由浙江黃罐食品公司提供； NaCl、KCl、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、順丁烯二酸(maleicacid)、曲拉通(Triton-100)、酒石酸鉀鈉、CuSO4、Na2HPO4、NaH2PO4等均為分析純，牛血清白蛋白(BSA)生化試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司；25～170 kDa Maker、5×上樣緩沖液、30%丙烯酰胺溶液等，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-100 CL型低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；D-130 電動勻漿機，Wiggens有限公司；GL-20B 高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；MCR301流變儀，奧地利安東帕公司；UV1100型紫外分光光度計，廣州罡然機電設備有限公司；SG2-ELK研究用酸度計，梅特勒-托利多公司；FA2004型電子分析天平，南京東邁科技儀器有限公司；AL104-IC型分析天平，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；HPP.L2-600/2 超高壓處理設備，天津華泰森淼有限公司；VC 750超聲波破碎儀，美國科爾帕默儀器有限公司；DZ-400-2D 真空包裝機，溫州市鹿城區(qū)黃龍華能機械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參考KATOH等[13]并作適當的修改。準確稱取5 g魚肉，加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內含0.16 mol/L KCl,20%TritonX-100,pH 7.5),均質(12 000 r/min,每次30 s，間隔1 min，重復4次)，離心(4 ℃，5 000 r/min,15 min),除上清液，繼續(xù)加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內含0.16 mol/L KCl, pH 7.5)清洗沉淀。均質-離心重復2次。用4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液清洗沉淀，離心棄上清液用8倍體積的0.1 mol/L NaCl清洗沉淀，紗布過濾，濾液離心，沉淀即為肌原纖維蛋白樣品，碎冰冷藏。

1.3.2 肌原纖維蛋白濃度的測定

雙縮脲法測肌原纖維蛋白的濃度[14]。

1.3.3 超聲波處理肌原纖維蛋白[15]

將肌原纖維蛋白稀釋至所需濃度，取適量蛋白樣品于玻璃燒杯中，將燒杯置于超聲波細胞破碎儀(超聲探頭為頻率 20 KHz，直徑 15 mm的鈦金屬探頭)，設置超聲振幅為40%，超聲時間分別為 0、3、6、9、12 min(超聲過程中工作時間和間歇時間分別為1 s和4 s)冰水浴控制樣品溫度為4～10 ℃，處理后的樣品于4 ℃冰箱內儲存，24 h內使用。

1.3.4 超高壓處理肌原纖維蛋白[16]

將肌原纖維蛋白稀釋到所需濃度，取適量蛋白溶液裝入聚乙烯復合膜高溫蒸煮袋中，并真空封口(不留頂隙)。將包裝好的樣品浸沒于超高壓設備壓力腔的傳壓介質中，設置過程壓力分別控制在100、200、300、400、500 MPa，保壓10 min，高壓介質為水，介質溫度為(23±2) ℃，卸壓時間<5 s。選擇未處理樣品作為空白對照。經高壓處理后的肌原纖維蛋白立即用冰水浴冷卻，并置于4 ℃冰箱保藏，24 h內使用。

孫正義：對于一個項目，只要有70%的成功概率，我就會出手；如果等到成功概率達到90%時，那可能就來不及了。

1.3.5 肌原纖維蛋白功能性質的測定[3]

1.3.5.1 溶解度的測定

取5 mg/mL的MP溶液于離心管中，5 000 r/min，離心40 min后，用雙縮脲法測定上清液中吸光度值，BSA做為標準蛋白。

(1)

1.3.5.2 乳化性質的測定[17]

取5 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液9 mL，加3 mL大豆油，9 500 r/min 均質1 min后，迅速從底部取出20 μL乳狀液，用0.1%的SDS稀釋到5 mL，漩渦30 s，使其混合均勻，然后于500 nm處測定吸光值A0，并于10 min后，再次從底部吸取20 μL稀釋到5 mL 0.1%的SDS溶液中，用SDS溶液做空白對照，測其吸光值為A10,用0.1%SDS溶液作空白對照。

(2)

(3)

式中：T=2.303;A0為均質迅速混勻后0 min時乳狀液的吸光值;A10為10 min 后乳狀液的吸光值;F為乳狀液中油體積分數(25%);t為時間(10 min);C為蛋白質質量濃度(g/mL)。

1.3.5.3 流變性質的測定[3]

超聲波處理的MP樣品(30 mg/mL)及超高壓處理的MP樣品(12 mg/mL)的流變性質通過流變儀來測定，溫度掃描測試選用平行錐板(PP50，d=49.985 mm) 測試應變力為0.02，頻率0.1 Hz，縫隙1 mm，掃描溫度范圍為20～80 ℃，升溫速率為1 ℃ /min，記錄G′的變化。

1.3.5.4 SDS-PAGE凝膠電泳

SDS-PAGE：參照LAEMMLI[18]的不連續(xù)電泳方法，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電極緩沖液含0.05 mol/L Tris, 0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS(pH 8.9)。電泳采用1 mm凝膠板；上樣量為10 μL;開始電泳時濃縮膠電流為80 mV，待樣品進入分離膠后電流改為120 mV;電泳結束后，取出膠片后用考馬斯亮藍染色50 min，再用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明。拍攝電泳膠片，觀察膠片中蛋白質條帶。標準分子量蛋白為低分子質量蛋白10～180 kDa。

2 結果與討論

2.1 溶解度分析

經超聲波處理后，鰹魚MP的溶解度變化如圖所示(圖1)，隨超聲時間延長，蛋白質的溶解度逐漸上升，從4.54%(未處理的MP)增加到48.49%(超聲12 min)。與未處理的MP相比，超聲處理的MP樣品的溶解度表現為極顯著升高(p<0.01)。其中，超聲6、9、12 min的樣品溶解度之間無顯著性差異。這可能是由于：肌原纖維蛋白經過超聲波處理后，由于空化作用產生較高的局部溫度，導致蛋白質分解，破壞了蛋白質的空間結構，增加了蛋白質與水之間的相互作用導致溶解度的增加；當超聲時間超過一定范圍時，蛋白質結構完全破壞，再延長超聲時間，溶解度無明顯變化。

圖1 超聲時間對鰹魚肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.1 The effects of ultrasound time on the solubility of the myofibrillar protein of skipjack

如圖2所示，經超高壓處理后的MP樣品，其溶解度與未處理的樣品相比，同樣表現出極顯著上升(p<0.01)。在0～200 MPa，肌原纖維蛋白溶解度隨壓力的增加而增大，當壓力為200～300 MPa時，溶解度變化不顯著；當壓力超過300 MPa后，溶解度逐漸下降，這可能是因為蛋白質在0～200 MPa處理后適度變性，親水基團暴露，導致溶解度的上升；當壓力超過300 MPa后，蛋白質內部的疏水基團大面積暴露，暴露的疏水基團聚集形成不溶性大分子聚集物，致使溶解度下降。由此可知，200～300 MPa處理后的MP溶解性最好。這與BRAVO和MARCOS等人的研究結果一致，BRAVO等[19]發(fā)現經高壓處理后的脫脂牛乳超離心上清液蛋白溶解度從0.1～250 MPa時上升，而后逐漸下降(250～900 MPa)。

圖2 超高壓強度對鰹魚肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.2 The effects of ultrahigh pressure intensity on the solubility of the myofibrillar protein of skipjack

2.2 乳化性分析

肌原纖維蛋白經超聲波處理后，其乳化性和乳化穩(wěn)定性的變化如圖3所示，超聲后MP的乳化性隨超聲時間的延長呈不斷上升的趨勢，可能是由于超聲處理破壞蛋白質分子的空間結構，使肌原纖維蛋白分子展開，暴露出埋藏在分子內部的疏水性基團，促進了肌原纖維蛋白在油/水界面上的展開，有利于形成穩(wěn)定的網絡結構。超聲處理后MP乳化穩(wěn)定性在短時間內是升高的，3 min時達到最大值23.2%，而后呈下降趨勢。MP溶液乳化穩(wěn)定性增加可能是因為蛋白質的表面疏水性增加，界面吸附的蛋白質濃度變大，界面張力減小，乳濁液更加穩(wěn)定。然而，隨著時間的延長，暴露出的內部疏水基團相互聚集，界面吸附的蛋白質濃度變小，因而乳濁液的穩(wěn)定性降低。此結論與常海霞[3]的結論相符合，草魚肌原纖維蛋白的乳化性隨超聲時間的延長呈現上升的趨勢，乳化穩(wěn)定性則先上升后下降，在3 min時達到最大值。

圖3 超聲時間對鰹魚肌原纖維蛋白乳化性的影響Fig.3 The effects of ultrasound time on the emulsification of the myofibrillar protein of skipjack

超高壓處理后的肌原纖維蛋白，其乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化如圖4所示。

圖4 超高壓強度對鰹魚肌原纖維蛋白乳化性的影響Fig.4 The effects of ultrahigh pressure intensity on the emulsification of the myofibrillar protein of skipjack

壓力<200 MPa時，乳化性及乳化穩(wěn)定性不斷上升，并且在200 MPa時達到最大值。壓力>200 MPa時，兩者均呈下降趨勢。乳化性上升的原因可能是由于蛋白質經0～200 MPa處理后適度變性，暴露出內部疏水基團，一般認為，蛋白質的疏水性越大，界面上吸附的蛋白質濃度越大，界面張力越小，乳濁液更穩(wěn)定。當壓力超過200 MPa時，高壓導致疏水基團之間的聚集和凝結，不溶性聚合物的增加，油水兩相逐漸分離，削弱其乳化性能。

2.3 流變性分析

流變的溫度掃描，可以較好地說明MP在加熱形成凝膠過程中的物理變化。由圖5可知，未經處理的肌原纖維蛋白的G′(彈性模量)在整個加熱過程中分成3個階段，20～38 ℃為凝膠的準備階段，G′隨溫度的升高而增加，是部分肌球蛋白交聯所致。38～47 ℃為凝膠劣化階段，G′隨溫度的上升而急劇下降，可能是由于肌球蛋白尾部的解螺旋轉變成無規(guī)則卷曲結構，這一轉變破壞了已經形成的蛋白質網狀結構，導致蛋白的流動性增強。47～80 ℃為凝膠強化階段。這是由于大部分肌球蛋白分子展開變成無規(guī)則卷曲結構，增加了蛋白質聚集物之間的縱向交聯程度，肌球蛋白重大的結構性轉變已經發(fā)生并且不可逆。彈性在黏彈性體系中占主導地位，凝膠網絡結構加強，形成穩(wěn)固的、不可逆的熱誘導凝膠[20-21]。通過超聲波處理后的樣品其流變曲線同樣分為3個階段：20～38 ℃為凝膠預備區(qū)，38～47 ℃為凝膠劣化區(qū)，但與原樣相比， 47～80 ℃樣品的G′不再隨著溫度的上升而增加，說明超聲波處理不利于肌原纖維蛋白成膠。在溫度為20～38 ℃時，超聲3～6min的樣品的G′相較于原樣偏高，超聲9～12 min的樣品的G′比原樣低，說明短時間的超聲處理有利于強化凝膠形成階段。同一溫度下，隨著超聲時間的延長，肌原纖維蛋白溶液的彈性呈明顯的下降趨勢，可能是由于隨著超聲時間的延長，超聲波的空化作用和機械作用更加完全，提供給肌原纖維蛋白分子更多的能量，使分子發(fā)生破碎，從而降低了溶液的彈性，流動性增強。

圖5 超聲時間對鰹魚肌原纖維蛋白流變性的影響Fig.5 The effects of ultrasound time on the rheological effects of the myofibrillar protein of skipjack

如圖6所示，與對照組肌原纖維蛋白(0 MPa)的儲能模量(G′)相比，100 MPa處理后的肌原纖維蛋白的G′ 略有下降但趨勢基本不變。當壓力超過200 MPa時，肌原纖維蛋白在41 ℃左右的變性峰消失，流變曲線為一條直線，這是因為壓力超過200 MPa時，大部分的肌原纖維蛋白已經變性。由圖可知，未處理的MP樣品的G′高于高壓處理后MP樣品的G′，且隨著壓力的增大，G′逐漸降低。原因可能是：經高壓誘導的蛋白質分子發(fā)生變性，改變了蛋白分子間相互作用，蛋白質結構發(fā)生明顯改變，導致儲能模量的下降。高壓處理后，在加熱過程中，G′的減少意味著蛋白質逐漸形成有序的聚集交聯和三維網絡凝膠，將更多的水分納入體系。

圖6 超高壓強度對鰹魚肌原纖維蛋白流變性的影響Fig.6 The effects of ultrahigh pressure intensity on the rheological effects of the myofibrillar protein of skipjack

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳分析

肌球蛋白由2條重鏈和4條輕鏈組成。肌動蛋白單體分子質量為43 kDa，原肌球蛋白為33～36 kDa[22]。超聲波處理后的MP經SDS-PAGE分析，結果如圖7-A所示，肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動蛋白(Actin)譜帶比較寬且明顯，說明MP的主要成分為肌球蛋白和肌動蛋白。與原樣相比，超聲處理后的肌原纖維蛋白MHC電泳譜帶變散，Actin條帶變粗，說明超聲處理后的MP出現蛋白降解片段，進而說明超聲波處理會引起蛋白質分子質量變化。 圖7-B為不同壓力強度處理后鰹魚MP的電泳圖譜。與對照組(0 MPa)相比，溫和高壓(≤300 MPa)使條帶逐漸變粗，這可能是因為未處理的蛋白質以大的聚集體的形式存在，經300 MPa及以下溫和高壓處理后，大的聚集體逐漸解體，使MHC, Actin等蛋白的濃度增大，進而使條帶逐漸變粗。當壓力≥300 MPa后，各條帶逐漸變淺。可能是由于高壓下蛋白質變性，暴露出內部疏水基團，疏水基團之間進行交聯，引發(fā)蛋白質分子聚集，形成大分子聚集物。這與HSU[23]和SHOJI等[24]的結論類似， 200 MPa下羅非魚的肌動球蛋白會交聯形成大分子聚集物，超過200 MPa時，各條帶變淺。也有研究表明，不同魚種經超高壓處理后的SDS-PAGE條帶也可能有所不同，馬海建[25]發(fā)現，超高壓處理后的草魚魚糜各組間電泳條帶無明顯差別，表明超高壓處理和對照組均能較好的使肌球蛋白發(fā)生聚集交聯；陸海霞等[26]的研究表明，秘魯魷魚MP經200 MPa及以上壓力處理15 min 后其 MHC 帶消失，并認為超高壓處理使MHC、Actin和副肌球蛋白按一定的比例聚集交聯形成凝膠；而邵明栓[27]的研究表明，白鰱魚糜經超高壓處理后，MHC只有少許變化。

0-marker;1-0 MPa;2-100 MPa;3-200 MPa;4-300 MPa；5-400 MPa；6-500 MPa圖7 超聲波時間(A)及超高壓強度(B)對鰹魚肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳條帶的影響Fig.7 The effects of ultrasound time (A) and ultrahigh pressure intensity (B) on SDS-PAGE bands of MP of skipjack

3 結論

本實驗探究超聲波、超高壓處理后鰹魚肌原纖維蛋白溶解度、乳化性等性質的變化，結果表明：超聲處理后的MP，其溶解度、乳化性均隨超聲時間的延長而增加；超高壓處理的MP，在200～300 MPa其溶解度最好，乳化性及乳化穩(wěn)定性在200 MPa時最優(yōu)；流變溫度掃描結果顯示，超聲波處理的MP樣品的流變曲線，在47 ℃之前與原樣基本一致，但47～80 ℃時，G′ 無明顯上升；100 MPa處理的MP， 其G′ 的變化趨勢在47 ℃之前與對照組無明顯差異，溫度超過47 ℃后，G′無明顯上升。當壓力超過200 MPa后，G′隨壓力的增加而下降，并且呈現一條直線。同一溫度下，未處理的 MP 樣品的G′高于高壓處理后MP樣品的G′，說明超聲波與超高壓處理均不利于肌原纖維蛋白的成膠。由SDS-PAGE電泳圖譜可知。與原樣相比，超聲處理后的肌原纖維蛋白MHC電泳譜帶變散，Actin條帶變粗。溫和高壓(≤300 MPa)使條帶逐漸變粗，當壓力≥300 MPa，各條帶逐漸變淺。說明超聲波和超高壓處理均會引起蛋白質分子質量變化。