張若蘭,劉慶國(guó),王敏,汪琨，朱廷恒

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

堿性蛋白酶是指用于水解蛋白質(zhì)或多肽并且在堿性環(huán)境下活力較高、穩(wěn)定性較好的一類(lèi)酶[1]，與酸性和中性蛋白酶相比具有作用范圍廣，水解能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，堿性蛋白酶廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)去除、食品制劑、皮革加工、醫(yī)藥和生物修復(fù)等方面[2-5]，大豆蛋白水解就是其中十分重要的一個(gè)方面。大豆蛋白的必需氨基酸含量豐富、組分齊全，與牛奶蛋白質(zhì)的氨基酸組成相近，是最具營(yíng)養(yǎng)的植物蛋白質(zhì)[6]，但是大豆蛋白中的大部分蛋白如β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子都是致敏性蛋白[7]，影響了其作為食物的可接受性,并且大豆蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)較為緊密，對(duì)酶解具有很強(qiáng)的抵抗力,不易被吸收, 使得其消化率和生物效價(jià)不及牛奶、蛋等動(dòng)物性蛋白。為了使植物蛋白質(zhì)成為優(yōu)質(zhì)蛋白養(yǎng)分更好的被利用吸收，在飼料和食品工業(yè)中，可添加堿性蛋白酶催化飼料中的大分子蛋白質(zhì)降解為肽和氨基酸。釀酒酵母是用于飼料和食品生產(chǎn)的益生菌，目前利用釀酒酵母表達(dá)堿性蛋白酶的研究較少?？莶菅挎邨U菌具有產(chǎn)蛋白酶量大、耐高溫等特點(diǎn)，從枯草芽孢桿菌中克隆堿性蛋白酶基因轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母中，獲得的產(chǎn)堿性蛋白酶酵母在食品和飼料生產(chǎn)中具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

我國(guó)的堿性蛋白酶研究存在微生物資源開(kāi)發(fā)不足，種類(lèi)較少，作用范圍較窄，酶制劑品種單一、價(jià)格昂貴等問(wèn)題[8]。目前大多堿性蛋白酶研究重點(diǎn)集中在高產(chǎn)菌的篩選、酶的分離和純化及酶的應(yīng)用等方面，而且大多是應(yīng)用在洗滌和皮革等行業(yè)[9-12]。在食品和醫(yī)藥工業(yè)中，主要應(yīng)用來(lái)自曲霉屬的堿性蛋白酶[13]，但是其發(fā)酵過(guò)程易受多種因素(如易污染或菌株生長(zhǎng)狀態(tài))影響。另外，米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶種類(lèi)較多，這增加了堿性蛋白酶的純化難度，阻礙了其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用[14]。

重組DNA技術(shù)和蛋白質(zhì)工程具有大幅提高酶的產(chǎn)量，推出量身定制的功能特性，包括穩(wěn)定性，催化活性和特異性，克服一些傳統(tǒng)菌種選育方法缺點(diǎn)等的優(yōu)勢(shì)[15-18]。基于堿性蛋白酶在食品發(fā)酵行業(yè)的廣泛需求，利用基因工程技術(shù)挖掘安全、價(jià)格低廉、菌體易于培養(yǎng)、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的菌株是未來(lái)研究亟待解決的問(wèn)題。

釀酒酵母在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，是一種典型的真核細(xì)胞模型和重要的模式生物[19]，可表達(dá)各種原核和真核來(lái)源的蛋白。釀酒酵母在飼料蛋白原料豆粕的發(fā)酵加工中是主要微生物，但是釀酒酵母幾乎沒(méi)有堿性蛋白酶活性，不能有效地去除豆粕中的抗原蛋白，本文將來(lái)自枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因克隆至釀酒酵母中構(gòu)建工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究，為堿性蛋白酶在食品發(fā)酵工業(yè)的更廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母Whu2d(尿嘧啶缺陷)、大腸桿菌(Escherichiacoli)(含有pYES2質(zhì)粒)、E.coliDH 5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶、試劑盒和試劑

rTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker和瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司；卡那霉素、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、小量DNA產(chǎn)物純化試劑盒、福林酚和酪蛋白等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；大豆胰蛋白酶抑制因子測(cè)定試劑盒、大豆球蛋白測(cè)定試劑盒、β-伴大豆球蛋白測(cè)定試劑盒等均購(gòu)自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司， 其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Biometra PCR儀、低溫離心機(jī)、MniniRUN Ge100型電泳槽、RH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊；UV7504分光光度計(jì)、JIRCAS 3UV Transilluminator紫外投射儀和超聲波破碎儀等。

1.2 方法

1.2.1 編碼枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶重組基因的獲得及其表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

1.2.2 釀酒酵母菌工程菌的構(gòu)建和驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pYES2-SAP通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母Whu2d中，轉(zhuǎn)化后分別涂布于YNB(URA3-)平板上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑取URA3+轉(zhuǎn)化子接到Y(jié)NB(URA3-)液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16 h，用試劑盒提取酵母質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α進(jìn)行擴(kuò)增。挑取克隆子用引物進(jìn)行PCR鑒定，F(xiàn)2: 5’- GAGGACCAAGAAGACATCA- 3’；R2: 5’- GTGGAGAAGCCATAGAGG - 3’，PCR擴(kuò)增條件同上，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子命名為 pYES2-SAP-Whu2d。

1.2.3 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)和堿性蛋白酶活力測(cè)定

挑取釀酒酵母轉(zhuǎn)化子接種于5 mL YNB(URA3-)液體培養(yǎng)基中，以28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后轉(zhuǎn)接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中。離心收集上清液，用福林酚法測(cè)定酶活，將0.025 mol/L硼酸-氫氧化鈉緩沖液(pH為10.5)配制的酪蛋白溶液，40 ℃預(yù)熱5 min。待測(cè)樣品1.00 mL，40 ℃水浴2 min；加酪蛋白溶液1.00 mL 40 ℃水浴10 min；加入2.0 mL濃度為0.4 mol/L的三氯乙酸，隨后以12 000 r/min離心10 min，取1.00 mL上清液加入5 mL濃度為0.40 mol/L的Na2CO3溶液和1 mL福林試劑，40 ℃保溫20 min，在680 nm下測(cè)定其OD值。40 ℃下1 mL反應(yīng)混合物每分鐘催化產(chǎn)生1 μg 酪氨酸的酶量定義為1個(gè)活力單位(U)。收集發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 溫度和pH對(duì)堿性蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響

將粗酶液反應(yīng)溫度設(shè)為30～60 ℃(梯度為5 ℃)探究堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度。在30～70 ℃(梯度為10 ℃)下處理粗酶液10～60 min 探究堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性。將粗酶液反應(yīng)pH值設(shè)為磷酸鹽-檸檬酸鈉(pH 7.0、7.2、7.6、8.0、9.0)、硼酸緩沖液(pH 10.5，pH 13.0)的不同pH值下探究堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH。然后在4 ℃、pH值7.0～13.0條件下處理粗酶液12 h測(cè)定殘余角蛋白酶酶活。未受任何處理的酶活性定為100%，各種處理的酶活與之對(duì)比，計(jì)算出相對(duì)活性。

1.2.5 金屬離子和蛋白酶抑制劑對(duì)酶活性的影響

將50 mmol/L MgSO4、MnCl2、BaCl2、CuSO4、ZnCl2、FeSO4、CaCl2、LiAc、CoCl2溶液，添加到反應(yīng)體系中探究金屬離子對(duì)酶活性的影響。在粗酶液中加入SDS、Tween60、Triton X-100、EDTANa2、β-巰基乙醇、PMSF等蛋白抑制劑4 ℃處理30 min，探究其對(duì)堿性蛋白酶活性的影響。

1.2.6 重組蛋白酶工程菌對(duì)豆粕中蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解研究

將釀酒酵母工程菌于5 mL液體YNB試管培養(yǎng)基中，200 r/min，28 ℃，搖床培養(yǎng)14～16 h。接入10%的菌液量于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃發(fā)酵48 h。用凱氏定氮法對(duì)發(fā)酵前后豆粕中的粗蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。用半微量法或全量法粗蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定發(fā)酵前后酸溶蛋白含量。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)定量測(cè)定試劑盒測(cè)定發(fā)酵前后豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶重組基因的獲得及其表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

2.1.1 堿性蛋白酶成熟肽編碼基因 (SAP)的PCR擴(kuò)增

含有堿性蛋白酶基因的pUC57-SAP質(zhì)粒DNA為模板，以F1/R1為引物，PCR擴(kuò)增得到1 181 bp源于枯草芽孢桿菌并經(jīng)密碼子優(yōu)化的堿性蛋白酶基因SAP。

2.1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將SAP基因DNA片段克隆到TA載體 pMD19，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α。用XhoⅠ、SphⅠ分別酶切表達(dá)質(zhì)粒pYES2和pMD19-SAP，連接獲得pYES2-SAP重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，使用含100 μg/mL 氨芐青霉素LB 平板培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性克隆。用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、SphⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到大小為1 181 bp和5 787 bp 的條帶，酶切驗(yàn)證正確 。

2.2 釀酒酵母菌工程菌的構(gòu)建和驗(yàn)證

將pYES2-SAP通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母Whu2d轉(zhuǎn)化液涂布于YNB(URA3-)固體培養(yǎng)基上，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，以F2/R2 為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。pYES2-SAP-Whu2d轉(zhuǎn)化子在975 bp處出現(xiàn)條帶，與理論值相符 。

2.3 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取17個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于YNB(URA3-)液體培養(yǎng)基，出發(fā)菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后，將所得菌體轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后對(duì)出發(fā)菌株和工程菌株上清液和胞內(nèi)液粗酶活進(jìn)行酶活測(cè)定。出發(fā)菌株與7號(hào)工程菌株的酶活有很大差異，對(duì)其進(jìn)行顯著性分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，兩者酶活存在顯著差異(p<0.01)，工程菌株比出發(fā)菌株的粗酶活高55.2%。證明SAP在釀酒酵母WHU2d中成功表達(dá)。收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)圖2,根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出來(lái)的堿性蛋白酶理論分子量是39.5 kDa，沒(méi)有看到目的蛋白的條帶，而通過(guò)酶活測(cè)定有酶活，證明堿性蛋白在釀酒酵母中表達(dá)了，但是表達(dá)量太少，通過(guò)SDS-PAGE看不出來(lái)。

圖1 酶活力顯著性差異Fig.1 The significance difference of enzyme activity* 代表差異的顯著性

M-maker;1-原始菌株; 2-空質(zhì)粒菌株; 3-重組菌株圖2 SDS-PAGE分析堿性蛋白酶的表達(dá)Fig.2 The analysis of Alkaline protease by SDS-PAGE

2.4 堿性蛋白酶酶活性質(zhì)分析

2.4.1 堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

由圖3-a可知，重組酶的最適溫度為45 ℃，溫度低于45 ℃時(shí)，酶活隨溫度上升而上升，當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，酶活迅速下降。將粗酶液置于30、40、50、60、70 ℃水浴中保溫20～60 min后，再與1%酪蛋白底物混合反應(yīng)，測(cè)定酶活，結(jié)果如圖3-b?？梢钥闯觯?0 ℃和40 ℃保溫1 h后，剩余的酶活分別為97%和90%，表明該粗蛋白酶在溫度低于40 ℃時(shí)酶活是穩(wěn)定的；當(dāng)溫度在50～60 ℃之間時(shí)，蛋白酶活性有所降低，但酶活仍在70%左右；高于60℃時(shí)，酶活迅速下降，70 ℃保溫60 min后，相對(duì)酶活接近于0。

圖3 溫度對(duì)蛋白酶粗酶活的影響Fig.3 Effects of temperature on the protease activitye

2.4.2 堿性蛋白酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

從圖4-a中可以看出，此蛋白酶從中性到堿性都有活性，在pH 8.0時(shí)，酶活達(dá)到最高。將粗酶液與不同pH的1%酪蛋白溶液混合后，4 ℃放置12 h，進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果如圖4-b?？梢钥闯?，該蛋白酶從中性到到堿性(pH7.6～10.5)酶活力較穩(wěn)定，而且相對(duì)酶活都在80%以上。只有pH在高于11或12時(shí)，酶活力才會(huì)明顯降低。因此確定該蛋白酶屬于堿性蛋白酶。

圖4 pH對(duì)蛋白酶粗酶活的影響Fig.4 Effects of pH on the protease activitye

2.4.3 金屬離子對(duì)堿性蛋白酶活性影響

將粗酶液與不同金屬離子溶液按比例混合，使得金屬離子的最終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，4 ℃放置30 min，測(cè)定酶活性，結(jié)果用相對(duì)酶活表示(反應(yīng)中加去離子水的酶活為100%)，見(jiàn)圖5。其中Mg2+、Li+和Co2+對(duì)該粗酶液酶活基本沒(méi)有影響；當(dāng)金屬離子為1 mmol/L時(shí)，Mn2+、Fe2+、Ca2+對(duì)酶活沒(méi)有明顯的影響，而B(niǎo)a2+、Cu2+、Zn2+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，但增加的幅度并不太大。當(dāng)金屬離子為5 mmol/L時(shí)，Ba2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+對(duì)酶活同樣有促進(jìn)作用，增加幅度略高于低濃度金屬離子。根據(jù)文獻(xiàn)得知微生物來(lái)源的堿性蛋白酶在一定濃度Mn2+存在時(shí)，Mn2+會(huì)提高堿性蛋白酶的活性，并能提高蛋白酶的溫度穩(wěn)定性[20]，而當(dāng)Mn2+的濃度為5 mmol/L時(shí)，對(duì)該蛋白酶酶活有明顯的促進(jìn)作用(p<0.01)，與理論相符。

圖5 金屬離子對(duì)蛋白酶粗酶活的影響Fig.5 Effects of different metal-ion on stability of the protease* 代表差異的顯著性

2.4.4 蛋白抑制劑對(duì)堿性蛋白酶活性影響

將粗酶液與不同的蛋白抑制劑混合，達(dá)到相應(yīng)的終濃度后，測(cè)定酶活性，得到的相對(duì)酶活如圖6?？梢钥闯?，EDTANa2和β-巰基乙醇(β-ME)對(duì)該蛋白酶的活性基本無(wú)影響；SDS是一種陰離子表面活性劑，1 mmol/L的SDS對(duì)該蛋白酶有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)濃度是10 mmol/L時(shí)，酶活有所降低，但酶活仍在90%以上；當(dāng)Tween 60濃度是1 mmol/L時(shí)，對(duì)蛋白酶活性基本無(wú)影響，而濃度是10 mmol/L時(shí)，酶活只有15%左右，對(duì)該蛋白酶酶活有明顯的抑制作用(p<0.01)；Triton X-100和PMSF對(duì)該蛋白酶的影響較大，在濃度是1 mmol/L和10 mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活都下降很多。

圖6 蛋白抑制劑對(duì)蛋白酶粗酶活的影響Fig.6 Effects of chemical reagent on the protease activity* 代表差異的顯著性

2.5 重組蛋白酶工程菌對(duì)豆粕中蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解研究

釀酒酵母工程菌株對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)誘導(dǎo)發(fā)酵48 h后，分別測(cè)定發(fā)酵前后豆粕樣品中的粗蛋白、酸溶蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量變化。工程菌株在固態(tài)發(fā)酵后，對(duì)豆粕中粗蛋白的增加無(wú)明顯效果，卻可以顯著增加酸溶蛋白的含量(圖7-a，p<0.01)，與出發(fā)菌株相比增加42.1%；在消除抗?fàn)I養(yǎng)因子方面，工程菌株去除β-伴大豆球蛋白的效果與出發(fā)菌株無(wú)顯著差異；而降解大豆球蛋白(圖7-b，p<0.05)和胰蛋白酶抑制因子與出發(fā)菌株存在顯著性差異(圖7-c，p<0.05)，降解能力分別比出發(fā)菌株提高41.9%和57.4%。

圖7 工程菌對(duì)豆粕中蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解Fig.7 Degradation of proteins and anti-nutritional factors in soybean meal by engineering bacteria*代表差異的顯著性

3 討論

本文克隆了枯草芽孢桿菌來(lái)源的重組堿性蛋白酶基因并在釀酒酵母中成功誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和豆粕中蛋白類(lèi)抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解效果進(jìn)行了研究。釀酒酵母的蛋白酶酶活很低，對(duì)豆粕中的大豆蛋白幾乎沒(méi)有分解能力。在本實(shí)驗(yàn)中，釀酒酵母工程菌與釀酒酵母出發(fā)菌株相比，堿性蛋白酶酶活提高55.2%，分解大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子能力分別提高41.9%和57.4%，分解大豆蛋白形成酸溶蛋白能力提高42.1%，這表明釀酒酵母工程菌在一定程度上可以解決大豆蛋白致敏作用強(qiáng)和利用率低的問(wèn)題。并且獲得的堿性蛋白酶直接分泌到發(fā)酵液中，利于該酶的分離純化和工程菌發(fā)酵處理飼料蛋白原料。該酶具有較寬泛的pH穩(wěn)定性和較高的熱穩(wěn)定性，能較好的適應(yīng)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的pH和溫度變化。以上結(jié)果顯示該重組堿性蛋白酶在飼料、食品生產(chǎn)中有較大的應(yīng)用潛力。